재하는 Na+- K 펌프(또는 Na·-K ' ATPase) 는 세 포 외부에 존재하는 2 분자의 K 홀 세포 내부로 이동시키는 동시에 세포 내부에 있는 3 분자의 Na+ 울 세포 외부로 이동시키는 데 관여하는 대표적인 펌프이다. 앞 에서 언급한 것처럼, 이 경우 ATP 의 가수분해를 수반하게 되 는 데 그 작용 기 작은 다음과 같다. 그림 6-2 에서 보는 바와 같이 Na + 이 ATPase 의 세 포 질 쪽에 결합하게 되면 ATPase 의 아스파르트산 (as partic a ci d) 이 인산화 되며, 이 Na+ 의존성 인산화가 ATPase 의 구조적인 변화 를 유도하게 되 며 동시에 Na + 이 세포 외부로 나가게 된다. 한편, 세포 외부의 K 이 결합 자리에 결합하면 K 의존성 탈인산화가 일어나며 이때 바뀐 ATPase 의 구조가 원래 상태로 돌아가며 K 이 세포 내부로 들어오게 된다 . 본 장에서는 이온 채널과 그곳에 관여하는 신호 전달 기작에 초점을 맞추고자 한다. 따라서 이온 채널을 이해하는 데 필요한 몇 가지 전기 생리학에 대한 개념 또는 용어를 살펴보기로 한다. 활동 전위 (ac ti on pote n ti al) 란 이온의 이동에 따라 생성되는 파로서 다

ir[7, \

시 말하면 생체막에 존 재하 는 이온 채 널을 통해서 이온이 이 동할 때 박 전위 (membrane pot en ti al) 의 변화가 생성되며 이러한 막 전위의 변화릅 활동 전위라 한댜 막 전위란 세포 내부 전위에서 외부 전위를 빼 준 값으 로 정의되는데, 일반적으로 외부 용액의 전위 를 0 mV( 기저 전위, gr ound pot en ti al) 로 고려할 수 있는데, 이 경우 막 전위는 곧 세 포 내 부 신 위 (int r ac ellular pot en ti al) 가 된댜 막 전위는 미세 전극 (m i crocle ct rocle) 으로 측정할 수 있는데, 이 전극과 연결되어 있 는 증폭기가 0 값윤 나타내다 가 외부에서 전압을 변화시켰을 때 갑자기 음 변화 ·릅 보여 주는 데 이때 막 전위 를 우리는 휴지 전위 또 는 휴지 막 전위라 하며 전형적 인 값은 -40 mV 에서 -100 mV 이다 이러한 막 전위 또는 막 전위의 변화 는 전압 크램프나 패치 크램프 기술을 이용하여 측정할 수 있 는 데 이 부분에 관 해서는 l 장에 언급된 바 있다. 식물 세포의 원형질막에는 H ♦ _ ATPase 가 존재하는데, 만약 외부 자 극 에 의해서 H ' -ATPase 가 활성화(제 3 장의 인지 질 대사에서 제 2 의 전령 중의 하나인 DAG 에 의해 활성화된 단백질 키나제에 의해 활 성화됩)되면 세포 내부의 H + 이 세포 외부로 이동하게 된다 . 이 경우 세포 내부 는 음 전하를 띠 게 되 며 이 러 한 현상을 과분극화라 하며 이 과분 극화 (h ype r ­ po l ariz a ti on) 에 의해서 어떤 다른 이온 예를 들어, 과분극화 의 존 성 K' 채널이 열리면서 세포 외부의 K 이 세포 내부로 들어오게 된다. 이때 세 포 내부는 양전하를 띠며 이 경우를 우리는 탈분극화 (de po l ari za ti on) 라 한다(1 -3). 6-2 어떻게 채널이 열리고 닫히는가? 이온 채널은 열리고 닫히는 기작에 따라 리간드-의존성 채널 (l ig and_ ga te d channel) 과 전압-의존성 채널 (vol tag e- g a ted channel) 로 나눌 수 있

다 . 리간 드 - 의존성 채널이란 리간드가 그 수용체에 결합함으로써 채널 의 3 차 구조가 변화되어 채널이 열리는 것이며, 전압 一 의존성 채널이란 생체막의 전압의 변화에 따라 채널이 가지고 있는 갑지기 (sensor) 에 인 지되고 따라서 동로가 열리는 것으로 여겨진다. 리간 드 - 의존성 채널로서 그 작용 가작이 잘 알려져 있는 것은 신경세 포 에 촌재하 는 아세틸 콜 린 수용체인데, 이 수용체를 통해서 채널이 열리 고 단히 는 기작 윤 살펴보기로 한다. 신경 자극이 신경 말단에 도착하게 되면 원형 질 막에서 탈분극화가 일어나고 이 탈분극화가 원형질막에 존 재하고 있 는 전압 - 의존성 Ca2· 채널을 열어 주게 된다. 이 때, 외부의 Ca 2· 이 내부로 들 어오게 되며, 층가된 신경 말단의 세포질 내의 Ca 안에 의해서 아세틸 콜 린이 생성된다. 생성된 아세틸콜린이 시냅스 후부 근육 세포의 원형질막에 있는 아세틸콜린 수용체에 결합하면서 방출되는 양 이온 들 에 의해 근육 세포의 자극이 일어난다. 여기서 아세틸콜린 수용체 는 곧 아세틸콜린에 의해 열리는 양이온 채널이다. 이들 채널의 열리고 닫히는 기 작은 지금까지 잘 알려지지 않았는데, 최근 9 A의 분해능을 가진 전자현미경에 의해서 그 기작이 밝혀지고 있다 (4). 먼저 아세틸콜린 수용체의 구조를 살펴보면, 이 수용체는 5 개의 막 관 몽 소단위체 (a, a, /J, r, 그리고 8) 가 링 구조를 형성하고 있다. 이들 5 개의 소단위체 중 두 개의 a 소단위체에 아세틸콜린 결합 자리를 갖고 있댜 각 소단위체는 약 500 개의 아미노산으로 구성되어 있으며 이 수용 체의 총 분자량은 약 300kDa 이다. 이들 중 대부분은 세포 외부에 위치 하고 있으며, 각 소단위체는 4 개의 a- 헬릭스 구조를 통해서 지질 2 중 층을 가로지르고 있다. 이들 4 개의 a- 헬릭스 중 오직 한 개의 a- 헬릭 스에 많은 극성 아미노산이 있는데, 각 소단위체에 존재하는 극성 a_ 헬 릭스 5 개가 모여 이온의 통과에 관여하는 수용성 구멍의 벽을 형성하고 있다(그림 6-3). 아세틸콜린 수용체의 3 차원적 구조를 살펴보면, 세포 외부는 매우 불

r 8

규칙적인 반면 세포 내부는 비교적 배열이 규칙적으로 이 루 어져 있다. 그림 6-4 에서 보는 바와 같이 이 이온 채널의 입구 쪽은 직경이 약 20-25 A 이며, 아세틸콜린 결합 자리는 막 표면으로부터 비교적 멀리 떨 어진 거리로서 약 20-30 A 정도이다 (5) ． 구멍을 이루는 a - 헬릭스 구조 는 4 개의 막 관통 부위 중 2 번째 (M2) 로 앞에서 언급한 것처 럼 극성을 띤 아미노산이 비교적 많이 존재하는데, 이것이 이온 채널을 열고 닫히 게 하는 데 매우 중요한 역할을 하고 있다. 이들 수용체의 세포질 부분 은 다양한 세포 골격 분자나 다른 조절 분자들, 즉 단백질 키나제와 같 은 분자들과 작용하고 있다 (6, 7). 이러한 구조를 가진 리간드에 의해 열리는 이온 채널이 어떻게 열리 고 닫히는지를 살펴보기로 한다. 먼저 세부적인 구조를 살펴보면, 앞에 서 언급한 것처럼 이온 채널의 입구는 20-25 A 으로서 막 표면으로부터 비교적 많이 떨어져 있는데, 이 부분은 일차적으로 적절한 이온을 통과 시키는데 그 역할이 있는 것으로 추정된다. 즉, 이 부분의 표면에는 비

M2

교적 음전하를 띠고 있는데 인력에 의해 양이온을 끌어 모으고 반발력 에 의해 음이온을 분산시키고 있다 (8). 다음 부분이 입구와 구멍 사이의 막 표면에 위치한 부분으로 비교적 좁은 상태인데 M2 단편의 끝부분으 로서 음전하를 띤 아미노산인 글루타민산이 존재한다. 마지막으로 가장 중요한 부분이 구멍으로서 극성을 띠는 M2 헬릭스와 각각 이온의 수화 된 표면 사이의 작용을 통해서 이온을 통과시키거나 통과시키지 않거나

s

를 결정한다. M2 헬릭스 단편에는 소수성 아미노산인 류신 251 이 있는 데 이 부분이 소수성 상호작용을 통해서 다른 M2 헬릭스의 류신과 강하 게 밀착되어 있기 때문에 a- 헬릭스 구조가 이 부분에서 휘어지게 되며 이온 채널이 닫혀지게 되면 수화된 이온들이 통과할 수 없게 된다(그림 6-5). 아세틸콜린이 수용체에 결합하게 되면, M2 단편의 또 다른 중요한 아미 노산인 트레오닌 244 가 류신 251 과 작용함으로서 류신 251 간의 소 수성 상호작용이 붕괴되면서 M2 의 a- 헬릭스가 바깥쪽으로 회전하게 된다. 따라서 이 a- 헬릭스의 회전이 소수성 상호작용에 의해서 밀착되 어 있는 류신 251 의 통로를 붕괴시키면 이온 채널이 열리게 된다 (9).

A B

다음은 전압-의존성 이온 채널이 열리고 닫히는 데 관여하는 작용 기 작을 살펴보기로 한다. Na•, Ca2•, 그리고 K' 채널을 포함하는 전압-의 존성 이온 채널의 경우 공통적인 구조를 포함하는 6 개의 생체막을 통 과하는 a- 헬릭스 구조를 갖고 있으며 이들 a - 헬릭스 구조가 (S1 으로부 터 S6 까지, 그림 6-6 참조) 원통형의 통로를 형성하는 구조이다 (10, 11, 12). N갑 채널의 경우 6 개의 이들 a- 헬릭스 중 두 개 (S5 와 S6) 는 친수 성 단편으로서 전하를 띤 아미노산 잔기를 갖고 있으며, 또 다른 3 개 (Sl, S2, 와 S3) 는 비록 소수성 단편이지만 약간의 전하를 띤 아미노산 잔기를

그림 6-7 전압-의존성 이온 채널의 중심부 를 생체막 의부에서 내려다 본 3 차 구조

갖고 있 는 것으 로 밝혀 졌 다 03, 14). 반면 S4 는 양전하 를 띤 아미노산 잔 기뿐만 아니라 소수성 아미노산 잔기도 갖고 있다. Sl 과 S6 는 세포질 쪽 에 인산화 자리 를 갖 고 있으며 S5 의 세포 외부 쪽에는 글리코실화 반응 부위 간 가지고 있다 04, 15, 16). S5 와 S6 사이에는 아주 짧은 두 개의 단 선 , SSI 과 SS2 가 존 재하 는 데 이 들 은 생체막을 통과하는 것이 아니라 a - 헨릭스 미리핀 (a - h e l i cal hair pin) 구 조로서 양전하 를 띤 S4 와 소수성 딘편 사이에서 완 충 역 할을 하며 특 히 SS2 는 음전하 를 띠면서 채널을 동 과하 는 잉이온음 선택하 는 데 관여하 는 것으로 밝혀졌다(1 7). 앞에서 언 급 한 것처럼 이 둘 단편 들 이 원통형의 구조 를 형성하고 있는 데 이 들 구조 를 살펴보기 로 한다. 그림 6 - 7 에서 보는 바와 같이 비교적 소수성 단편 들 인 Sl, S2, S3 와 S5 는 원통의 외각을 형성하며 중앙에는 SSl 과 S6 가 서 로 상호작용하고 있고 가장 안쪽, 즉 이온들이 통과하는 구 명 부위에는 S 4 와 SS2 가 존 재한다. 그림 6 - 7 에서 S6n 이란 S6 단편의 - 말 단 부위가 위쪽으 로 노 출 되어 있음을 의미하며, 그림 6- 7 A의 S4h 란 S4 단편 중 양전하 를 띠지 않는 중간 부위를 의미하며 그림 6-7 B 의 S4c 는 양전하 를 띤 C - 말단 부위 를 의미하고 있다. 그 렇다면 이러한 구조를 가진 전압-의존성 이온 채널이 어떻게 열리 고 닫히는가에 대해서 살펴보기로 한다 . 먼저 그림 6-7 A 에서 보는 바 와 같이 S4 단편의 양전하 부위가 SSl 이나 S6n 의 음전하 부위에 상호 작용함으로써 S4h 가 구멍 쪽으로 모이면서 생체막과는 수직 형태를 유 지한댜 따라서 구멍의 지름이 비교적 좁은 상태를 유지하고 있다. 이온 채널이 열릴 때에 S4 단편의 a- 헬릭스가 회전되면서, 마치 S4 의 a- 헬 릭스가 막과 수직 상태에서 막 표면의 바깥쪽으로 이동하는 것처럼 되 면서 S4C 가 노출되 고, S4C 의 f3-구조가 SS2 의 f3 -구조와 상호 작용함 으로써 구멍의 크기가 증가하면서 이온 채널이 열리게 된다 (12) .

6-3 이온 채널 사실 1960 년대 중반까지는 이온 들 이 어떻게 세포막 을 통과하여 이 동 하는지에 대해서 잘 알려지지 않았다. 단지, 약리학 적 실험을 동해 서 어 떠한 이온들이 막을 통과하는지 또는 통과하지 못하는지릅 알게 되었다. 따라서 이온 채널의 분류 및 특 성을 이해하가 위해서 는 약품이나 독성 물질을 포함하는 약리 시약과의 관계를 먼저 이해하여야 한다. 1964 년 Narahasi(2 0) 등이 테트로도 독소(t e t rodo t ox i n, TI'X) 는 바다 가재의 거대 축색 돌기(l obs t er gian t axon) 에 존 재하 는 Na’ 체 널을 선택 적으로 억제하지만 K 채널에는 영향을 미치지 않는다는 사 실을 전압 크램프 실험을 통해서 처음 밝혔다 . 그 후 Hi lle 은 신경세포에서 TTX 에 의해 Na 令 채널은 억제되었지만 K 채널은 영향을 받지 않았다 는 결과 (21) 를 보고함으로써 확인하였고, TEA( t e tra e t hy larnmo ni um) 에 의 해 K 채널은 억제되었으나 Na 令 채널은 억제되지 않았다는 실험 결과를 보고 하였다 (22). 이 들 독소 이외 에 도, 또 다른 중요한 독소는 삭시 독소 (s axit o xi n) 인데, 이 STX 는 TTX 처럼 Na• 채널을 억제하는 것으로 나타 났다 (23, 24). 그 의에도 무기 양이온인 Cs t 나 Ba2t 또한 K 채널 을 억제 하며 프로카인(p roc ain e) 은 Na+ 채널을 억제하고 있다. 이들 시약의 작용 메커니즘은 이들이 이온 채널의 입구(이온 선택 필터)에 결합함으로써 이온 채널을 억제하는 것으로 여겨진다. 본 절에서는 Ca2+, K\ Na+, 그리고 er 채널에 관해서 알아보았는데 이들 이온 채널은 일반적으로 억제제의 종류 즉, 약리 시약에 의해서 분 류되며 이온의 이동 방향, 막 전위, 또는 이온 채널에 결합하는 리간드 에 의해서도 분류된다.

6-3-1 Ca2+ 채널 평상시 Ca2 ’ 채널은 닫혀 있는데, 외부 자극이나 신호에 의해 채널이 연리면 Ca 2 ’ 의 전기 화학적 기울기에 의해 채널을 통해서 초당 수 백만 개의 C 같이 세포 내로 들 어가게 된다 Ca 2 ♦ 채널은 일반적으로 원형질막 에 존 재하 는 데 세포 소기관의 막에도 존재한다. 이들의 역할은 세포 소 기관( 소포 체나 다 은 소기관)으로부터 Ca 2+ 을 세포질 내로 이동시키는 데 관여 하고 있다 (25, 26). Ca2’ 채널은 열리고 닫히는 매커니즘을 기초로 하여 크게 2 가지 유형 으로 나 눌 수 있는데, 전압 - 의존성 C 訖 채널과 수용체가 직접 작용하는 Ca2’ 채널이 그것이다(그림 6-8, 업). 전압-의존성 Ca2+ 채널은 생체막의 탈분극화에 반응하여 열리는데, 이들 채널의 전압 민감도, 운동 성질, 그 리고 약리 시약에 대한 민감도에 따라 다시 L- 형, T- 형, N- 형으로 구분 된다. 수용체가 직접 작용하는 Ca 안 채널 (rece pt or-ope ra ted Ca2• channel) 은 IP3 수용체 채널이나 리아노딘 수용체 채널처럼 수용체 의존성 기작 에 의해서 열리는 채널을 말한다. 전압 - 의존성 C 武 채널에 대해서는 지금까지 다양하게 연구되었는데 (28, 29, 30), 그림 6-8 에서 보는 바와 같이 L- 형은 높은 전압(― 2 - -10 mV) 에서 활성화되며, 비교적 천천히 반응하는 채널인데, 큰 전기 전도 력 (conduc tan ce, -25 p S) 을 갖는 특성이 있다. T- 형은 낮은 전압 (-7 - -70 mV) 에서 활성화되며, 일시적인 전류를 갖고 비교적 빠르게 반옹한 댜 이 유형의 채널은 적은 양의 전기 전도력(― 9 pS)을 갖는다 . 끝으로 N- 형은 비교적 높은 전압(> -30 mV) 과 T- 와 L- 형의 중간 정도에 해 당되는 일시적인 전류 (-15 pS)를 갖는다. 대부분의 세포는 하나, 또는 그 이상의 전압_의존성 Ca2• 채널을 갖고 있다. 예를 들면 감각 뉴런 (sensory neuron) 에는 T, N, 그리고 L- 형의 Ca 안 채널 모두를 갖고 있는 데 (29, 30, 31), 교감 신경세포 (s ymp a th e ti c neuron) 의 경우에는 T- 형은

존재하지 않고 L ― 과 N - 형만이 존재하는 것으로 알려졌다 (32). 결국 이 둘 각각의 유형 들 은 서로 다른 고유의 기능을 갖고 있는 것으로 알려져 있 는 데 (33, 34), 각기 다른 세포에 존재하는 이들 각 유형의 Ca 2 令 채널의 정확한 기능에 관해서는 좀더 많은 정보가 요구되는 실정이다. 수용체가 직접 작용하는 Ca 2 令 채널에는 크게 두 가지로 나눌 수 있는 데 그립 6 - 8 에서 보 는 바와 같이 리간드에 의해서 활성화된 수용체가 Ca2’ 채년을 열리게 하는 채널과 제 4 장 Ca 인 에서 살펴본 수용체 그 자 체가 Ca2’ 채 널 인 IP:i 수 용체나 리아노딘 수용체 채널을 들 수 있다. 후 자에 관해서 이미 언급한 관계로 여기서는 전자에 대해서만 언급하기로 한댜 이러한 유형의 채 널 에는 니코틴 아세틸콜린 수용체와 결합하고 있 는 Ca 언 뿐만 아니라 다 른 양이온들도 이동할 수 있는 비특이적 이온 채 널이 여기에 속한다 (35). 또 다른 예로서 ATP 수용체의 활성화에 의해 서 열리는 C 武 채널이 평활근 세포에서 발견되었다 (36). 비록 수용체가 직접 작용하는 Ca2` 채널에 비해서 정보가 부족하지만 현재 다양하게 연 구되고 있다. Ca2' 채널에 영향을 미치는 시약들은 크게 세 가지 계열로 나눌 수 있 는데, 1, 4-di hy d r op yridine (D H P) 유도체 계열, ph eny la lk yla m ine , 그리고 benzoth iaz epi ne 등이 댜 Nit ren d ipine , nimodipine , PN200-110 과 BayK 8644 등이 DHP 유도체에 속하며, verapa mil, D - 600 과 D-888 등은 p hen y lalk y l ami ne 에 속한다 . 이들 약리 시약들은 특별한 유형의 Ca 안 채 널들을 저해하고 있댜 DHP 유도체들은 오직 L- 형 Ca2 令 채널을 저해하 기 때문에 흔히 L- 형 채널은 dihy d r op yridine -sensiti ve ca2 ♦ 채널이라 일 컬어지기도 한댜 그러나 이들 시약들이 Ca2+ 채널을 저해만 하는 것이 아니라 때로는 활성화시키기도 하며 세포에 따라, Ca2+ 채널의 종류에 따라 그 작용 기작이 다르게 나타나는 것으로 알려졌다 (37). Ca2+ 채널을 조절하는 또 다른 시약으로서 (1)－ cono t o xi n( (1) -CT) 을 들 수 있는데, (1)-C T 또한 L- 형을 조절하는데 DHP 와는 다른 자리를 갖고

있다 (38). (L) - CT 은 N- 형의 Ca2 ’ 채 널 에도 억제제 로 서 작용 하 는 데 요 도 화 형태의 (L) -CT 는 N- 채널의 분리와 생화학적 특 성 음 규명하는데 아주 중요한 도구로 사용되고 있다 (39) . 왜냐하면 L - 형 의 경우보다는 N - 형의 채널에 (L)- CT 결합 자리가 훨 씬 많이 있으며, 또한 N - 유형의 경우 (L)- CT 결합 자리가 다양하고 폭넓게 분포되어 있기 때 문 이다 (40). 이들 세 가지 유형의 C 武 채널이 각각 다 른 특 성 을 갖지 만 , 공몽적인 운동 성질을 갖고 있다. 이 들 모두 는 막의 탈분극화에 의해 환성화 되 는 데, 가장 높은 탈분극화가 일어날 때 이 들 채 널 이 최대로 열리게 된다 (4l). 그러나 Ca 안 채널은 탈분극화가 일어나자마자 열리는 것이 아니라 약간 지체된 후 나타나는데, 신경 세포에 있 는 T - 형 Ca2 ’ 채 널 의 열리고 닫히는 시간은 축색돌기에 있는 N 집 채널보다 최대 50 배 정도 느린 것 으로 나타났다 (41) . Ca 언 채널도 N 터이나 K ' － 채널처럼 막이 재분 극화 (repo la r iza ti on ), 즉 음 전위를 가질 때 닫힌다. Na' 채 널 과 마찬가지 로 Ca2+ 채널은 전압의 변화에 따라 닫힌 상태, 열린 상태, 그리고 바 활성화 상태로 구분된댜 그러나 Ca 안 채널이 단순히 전압의 변화에 영향 을 받 는 것만은 아니댜 막을 통과하는 Ca2• 전류에 의해서도 채 널 의 상태가 변화되는데, 세포 내부의 Ca2+ 농도가 높으면 높을수록 막을 통 과하 는 Ca2+ 전류는 적 어 진다 (42-44). 6-3- 2 Na+ 과 K+ 채널 본 절 앞부분에서 약리 시 약에 따라 구별되는 Na• 과 K+ 채널에 관해 서 간단히 언급하였다. 본 절에서는 이들 채널의 구조와 활성화 메커니 즘, 그리고 세포 내에 존재하는 이들 채널의 다양성에 관해서 언급하고 자 한다. l

몇 N 비 채널의 주요 소단위체 를 클로닝하기에 이르렀다. 이들 결과로부 터 전압 - 의 존 성 N터 또는 K 채널의 가상적 수송 메커니즘을 유추할 수 있 는 데, 그림 6 - 9 에서 작동 가설을 보여주고 있다. 채널은 막을 가로지 르는 단백질로서 세포 바깥 표면에는 많은 글리코실화 반응을 하는 자 리가 있으며 세포 내부 는 고정 (anchor) 단백질과 결합하고 있거나 세포 곱격 과 연건되어 있다. 이온 들 이 막을 통과할 수 있는 물로 채워진 통로 로 이 부 어져 있으며, 이 들 채널의 기능 부위로서 이온을 선택할 수 있는 필 터, 통로, 그 리고 감지기가 촌재한다(그림 6-9 참조). Na’ 과 I( 채 널 이 구조적인 면에서 비슷함에도 불구하고, 서로 다른 전압 의 존 성 방식을 보여주고 있는데, 대부분의 세포에서 N타 채널의 열 림은 -8 0mV 로부터 —4 0 mV 사이에서 탈분극화에 의해서 유도되는 데 반해 K 채널의 열림을 위한 전위 범위는 -100 mV 로부터 +50 mV 이 다 (2) . 전압 - 의 존성 K 채널은 N 집 채널에 비해서 다양성을 가지고 있는 데, 대부분의 경우 막의 탈분국화에 의하여 열리는 데 반해, 몇몇의 경우 과 분국화 에 의해서 열린다. 표 6-1 에서 다양한 그 채널을 저해하는 시약 등을 보여주고 있다. 채널은 외부 전압을 증가시킨 후 잠시 지연된 후에야 막을 통과하는 K 전류의 변화가 일어나기 때문 에 붙 여진 이름이다 (45). 이 채널이 비록 세포 바깥이나 내부에서 TEA 에 의해 저해되지만 , 저해를 위한 TEA 의 농도는 세포에 따라, 그리고 외부 또는 내부에 따라 다양하다. 예를 들어, M yxi cola 의 축색돌기에 존 재하는 K 채널의 경우, 50% 의 저해를 위해서는 외부에는 0.4 m M TEA 가 필요한데 반해 내부에는 24mM TEA 가 요구된다 (46). 그러나 오징어 거대 축색돌기의 경우에는 250mM TEA 에 의해서도 아무런 영향을 받 지 않았다 (47). 세포막의 과분극화에 의해서 횔·성화되는 K 채널이 있는데, 매우 빠 르고 일시적인 K 전류를 보여주며, 이는 세포 의부로 흐르는 일시적인 K 전류이고 우리는 이를 A 전류, IA, 또는 A 채널이라고도 한다 (48).

지질 이 중 막

Ca 2• - 의존성 K 채널의 활성화는 A 채널과는 달리 상당히 길 고 많은 양 의 K 전류가 흐른다 (49). 이외에도 다양한 K 채널이 존재하고 있는데 반해 Na• 채널은 K' 채 널과 비교하여 그리 다양하지 못하다. TTX 에 빠르게 반응하는 Na• 채 널과 느리게 반응하는 N 깊 채널이 존재하며 (50), 비교적 빠르게 반응하 는 채널과 느리게 반응하는 채널이 있다 (51) . 일반적으로 Na• 채널은 0 rnV 에서 거의 95 % 이상 비활성화되는데, 오징어 거대 축색돌기에 존재

표 6-1 K 채널의 억재재 (2) 들 약자 ; TEA, tel raeth y la mmoniu m QA, qu ar tem a ry ammoniu m ion s relate d to TEA Pota s s iu m Membrane- cha n n e l Acti ng from outs id e Acti ng from ins i d e perm eant Delay ed TEA TEA and QA 4-A mino p yridine re'Ct ifier Cs \ H', B a2· cs·, Na·, Li, Ba2· Str ych n ine Cap sa i c in (f ~ ) Quini d ine Dendroto x in s (J i ) Noxiu s t o x in A TEA TEA 4-A rnino p yridine De nc lroto x in s Quinid ine ? K(Cal TEA(I 3K J TEA Quinid ine cs· Na·, Ba2· Ap amin( SK) Cha ryb doto x j n( B K J Inward TEA H·, r v1 g2 · ? rec ti fi er cs·, R b. Na· K(ATP) BTaE2A· ’ Sr2· TEA Tolbuta mide Cs\ Ba2· Na', l\1g2· Gli be nclam ide Quinidine 하는 한 Na• 채널은 +80mV 에서도 Na• 전기 전도력이 남아 있다 (52). N 검 채널의 이온 선택성은 K 채널의 선택성에 비해 특이성이 적은데, 작은 금속 이온의 선택 순서는 Na' ::::: Li' > Ti ' > K+ > Rb+ > Cs • 이 댜 또한 hy dr oxy la mmon iur n, hy dr azin iur n, ammo ni um 과 같은 비메틸화 유기 양이온도 Na+ 채널을 통과할 수 있는데 이는 최소 구멍의 크기가 3 A x 5 A( 채널의 이온 선택 필터)임을 암시하고 있다 (53). 메틸암모늄 과 같은 메틸화 유기 양이온은 Na+ 채널을 통해서 막을 통과할 수 없다 는 사실 또한 이를 뒷받침하고 있다.

지 금 까지 생체막 생화 학 자나 전기 생리학자 들 의 가 장 풀 리 지 않은 의 문 중의 하나 는 < 왜 K · 보다 크기가 작은 N a 이 K 채 널을 봉 과 한 수 없느냐 > 하는 것이었다 . 최 근 에 발 표 된 두 개의 논문 이 이 의 문점 에 대 한 실 마리 를 제공하고 있다 ( 54, 55). N 집의 지 름 이 약 1.9 A 이며 K 의 지 름 은 2.7 A 이다. Toney( 5 4) 등은 I( － 특 이적 결합 자리 를 갖고 있 는 단 백 질 인 dialk y lg ly c in e decarbox y las e (D GD) 을 통 해서 K 또 는 Na’ 과의 상호작용에 따 른 구조 를 규명하였다. DGD 의 K 전합 자리 는 3 개의 카 르보닐기 (O = C), 1 개의 카 르 복실기 (O - C - A s p - 0) , 1 개의 히 드록 실 기 ( 0 —S er), 그리고 물분자의 산소와 함 께 6 개의 산 소로 구 성 됨 으 로 서 K ’ 과 배위 결합을 형성하는데 이는 I( － 선택성 i on o p hor e 인 va li nom y c i n e 의 구 조와 비슷하다 (v ali nom y c i ne 의 경우 , 6 개의 산 소 와 K 이 배위 결합을 형 성 하고 있음)． 이때 이 결합 자리는 8 면체 구조를 이 루 고 있다 . D G D 의 K' 결합 자리는 매우 높은 K 선택성을 갖 고 있는데 , 예 를 들 어 용 액에 7.5 mM K 따 75mM Na • 이 있음에도 불구하고 K 만이 선택 적 으 로 결합된 다. 만약 이 용액의 K 을 제거하면 DGD 의 결합 자리에 어떤 변화가 생 길 것인가? Toney (5 4) 등의 결과에 의하면 용액에 K • 을 제거하 였을 때 , DGD 의 결합 자리가 형성하는 8 면체 구조가 정확하게 0.8 A 줄 어 둘면 서 삼각-양추(trig onal- bip yramida l) 구조로 바뀌 게 된다. 따라서 K 에 비 해 서 0.8 A 작은 Na 이 팔면체 구조를 통과할 수 있지만 그 구 조 가 바뀜 에 따라 결합 자리에 밀접하게 결합함으로서 통과할 수 없게 된다. 비 록 이러한 구조 변화가 K 채널의 구조 를 통해서 연구된 것은 아니지만 K• 채널과 Na+ 채널 사이에서, 그리고 이들 채널의 이온 선택성을 이해하는 데 실마리를 제공해 주고 있는 것은 사실이다. 6-3- 3 er 채널 생체 내에서 가장 널리 생리학적으로 이용되는 이온이 Cl - 이다 . 동물

세포에서 세 포질 내의 C 「 농도는 항상 세포 외부의 Cl~ 농도보다 낮은 데(포유 동물 의 골격근 의 경우 세포 외부의 Cl~ 농도는 123mM, 세포질 내 의 Cl- 농 도는 4.2m ivI), 평형 전위는 거의 휴지 전위와 일치한다 (-90 mV). Cl 의 중 요한 역할은 pH 조절, 세포 부피의 조절, 그리고 분비샘으 로부 터 분 비액을 생산하는 데 관여하는 것으로 알려져 있다 . Cl 채널은 크 게 네 가지 로 구분할 수 있는데 리간드에 의해 열리는 채 널로 서 r - 아미 노부 티 르 산( r-a m ino buty ric acid , GABA) 이 리간드로 작용하는 GABA - 의존성 채 널 (GABA- g a t ed channel), 분비성 (secre t o ry) 의 CI 채널로서 CFTR( 소낭 섬유증 막 통과 전기 전도력 조절자, cys t ic fibr osis tra nsmembrane conducta n ce reg u lato r , )과 Ca 2+ 에 의해 활성화되 는 er 체널, 그리고 전압-의존성 er 채널이 있다. 이들 중에서 GABA- 의 존성 채 널, CFTR 과 Ca 2 에 의 해 활성 화되 는 er 채 널 (Ca2 - -ac ti va t ed er chann e l) 에 관해서 간단히 알아보기로 한다. 앞에서 살펴본 아세틸콜린과 같은 신경 전달 물질은 이들이 수용체에 결합 하여 양이온 채널을 열어 줌으로써 신경 물질 전달에 관여하는 데 비해서, GABA 는 수용체에 결합함으로써 수용체와 연결되어 있는 er 채널을 열어 주게 되고, 따라서 Cl - 이 세포 내부에 들어오게 됨으로써 신경 전달 물질의 전달 반응을 저해하는 데 관여한다. 이 GABA 수용체 채널의 구조는 다른 리간드-의존성 수용체안 아세틸콜린 수용체와 비슷 한 것으로 알려져 있다. GABA 수용체는 대뇌 피질로부터 분리 정제되 어졌는데, 아미노산 서열이 거의 비슷한 3 개 또는 4 개의 소단위체 유형 으로 구성된 중합체이다 (5b, 5f) . a, fJ, 그리고 r- 소단위체로 구성된 GABA 수용체의 각 소단위체는 GABA 결합 자리를 갖고 있으며, GABA 수용체의 활성 기작 역시 아세틸콜린 수용체에서 보여준 활성화 기작과 비슷한 것으로 알려져 있다. 소낭 섬유증 (c y s ti c fibr osis , CF) 은 신경 과학자의 관심을 끌기에 충분 한데, 왜냐하면 질병과 관련된 이온 채널과 연결되어 있기 때문이다. 소

I MS D 1 \ / MS D 2 \

낭 섬유증은 췌장 , 침샘 , 기공 점 액, 그리고 땀 샘 분비성 코일과 같은 몇 몇 상피 조직의 분비 기능을 손상시키 는 것 으 로 알려져 있다 . 최 근 에 CFrR 을 만드는 유전자가 발견되었으며 (58), 그 리고 소 낭 섬 유 증 관련 돌연변이체만도 200 개가 넘는 것으로 보고되었다 (59). CFrR 은 그림 6-10 에서 보여주는 바와 같이 두 개의 막 관통 부 위 (MSDl 과 MSD2) 를 갖고 있다 이 들 각각은 6 개의 막 통 과 단 편 (Ml -M12) 으로 구성되어 있다. 또한 이들 각각은 뉴 클 레오티드 결 합 자리 (NBDl 과 NBD2) 를 갖고 있으며 MSDl 과 MSD2 의 연결 루 프 부분에 하 나의 조절 부위(R)를 갖고 있다. 이 CFrR 이 er 채널이기도 하다. 이 CFrR 이 Cl- 채 널이라는 사실은 정상 세포에서는 CFrR 이 존재하지 않 는 NIH3T3, CHO 세포, 그리고 개구리 난세포 등에 CFrR 유전자를 넣 어 줌으로써 cAMP 에 의 해 활성 화되 는 Cl - 의 이 동을 확인함으로써 밝혀 졌다 (60, 61, 62). 이 CFrR 의 돌연변이가 소낭 섬유층의 원인이 되며 궁 극적으로 관련 질병을 유발하게 되는데, 이들 돌연변이체는 크게 4 가지

로 구분된댜 유전자 결합 에 의해 이 CFrR 자체에 결 합이 생기는 경우, 생성된 CFrR 이 소포체에서 골지체로 진행되는 과정에 결함이 생기는 경우, N BDl 이나 NB D2 의 돌 연변이에 따 른 ATP 결합이 불가능하게 되 면서 조전 기능이 상실되는 경 우, 그리고 막의 구멍을 이루고 있는 아미 노산의 듄연변 이에 따른 Cl 의 이동이 불가능한 경우 등에 의해서 주로 소낭 심유증의 원인이 되 는 것으로 알려졌다 (63). 이 듈 중 Cl 의 이 동과 직접 관련이 있는 조절 결함과 전기 전도력 결 함을 내 포 하 는 돌연변 이체 를 통해 C 「 이동 기작을 알아보기로 한다. 조 절기능에 결함 이 있는 경우는 다시 두 가지로 나누어서 생각할 수 있는 데 , ATP 가 결합 하 는 NBDl 이나 NBD2 의 돌 연변이에 의한 경우 조절 부 위 (R)의 결합 에 의해 인산화가 불가능한 경우이다. 먼저 NBDl 의 551 번째 아미 노산 굴리신 이 아스파라진이나 세린으로 바뀐 돌연변이는 혼치 않댜 NBD2 의 1244 번째 굴 리신이 글루 타민산으로, 세린 1255 가 프롤린으 로 또는 글 리신 1349 가 아스파라진 등으로 돌연변이되는 경우인데 이것 도 혼치는 않다. 이 들 돌연변이체들은 ATP 가 결합 자리에 결합할 수 없 기 때문에 cvrR er 채널을 열어 주지 못하게 됨으로써 Cl - 의 이동이 어 립 게 된다. 또 다른 돌연변이로서 조절 부위의 결함에 의해 유도되는 경우를 들 수 있는데, 조절 부위의 돌연변이체가 보고되었으나, 다른 부 위의 돌연변이에 비해서 크게 치명적이지 못한데 이는 인산화의 한 기능 이 소낭 섬유증을 유도하는 데 충분하지 않음을 시사해 주고 있다. CFrR 의 구멍 부위 죽 , MSD 의 돌연변이에 의한 Cl - 의 이동이 억제됨 으로써 소낭 섬유증을 유도하는 경우안데, MSDl 의 117 번째의 아르기닌 이 히스티딘으로, 334 번째의 아르기닌이 트립토판으로 , 그리고 347 번째 의 아르기닌이 프롤린으로 바뀐 경우가 보고되었다 (59) . cAMP 의존성 인산화 기능과 ATP 결합이 정상이면서 단지 이들 돌연변이체의 er 이 동 양을 측정 해 보면 R 347 P > R 117 H > R 334 W 순으로 나타났다. 이는 CFrR 의 구멍을 구성하는 양전하의 아르기닌이 Cl- 의 이동에 관여

하고 있음을 시사해 주고 있다 (64). 기 금 까지 돌 연변이체 를 봉 해서 CFTR er 채널에 대해서 살펴보았는데 , 간략하게 이 채 널 의 기작을 정 리해 보면, ATP 의 결합에 의해 활 성화되면 CFTR er 채 널 이 열 리게 되 며, cAMP 의 생성이 유도되고 이것에 의해 채 널 이 조절 되 는 것 으 로 여 겨진댜 그러나 아직까지 그 정확한 기작은 밝혀지지 않 고 있다 . 끝으로 Ca 2 t -의존성 er 채널에 대해서 알아보기 로 하 겠 다 . C a2’ 에 의 해 활성화되는 er 채널은 간상 세포 광수용체와 개구리 난세포에서 처 음 보고되었는데 (65 , 66), 그 후 많은 신경세 포, 분 비 세 포, 근육 세 포 등 다양한 세포에서 그 존재가 확인되었다 (67 - 69). 이 채널은 CI . 뿐만 아니 라 많은 작은 분자의 음이온도 폭넓게 통과시키며 Ca 2 t 의 증가에 의해서 뿐만 아니라 탈분극화에 의해서도 열려지는 것 으로 밝혀 졌 다 (68). 이 채 널은 또한 전압 의존성은 약한 반면 Ca2‘ 결합에 의해서는 강하게 작용 하지만 다른 전압-의존성 채널인 Na', K' , 그 리고 Ca2’ 채널에 비해서 는 약한 것으로 알려졌다 . 최근에는 개구리 난세포에 있는 이 Ca 양 에 의해 활 성화되 는 er 채널 은 니플름산(niflumi c ac i d) 이나 플루페남산(fl u f en ami c ac i d) 에 의해서 억 제 되 고 있음이 밝혀 졌다 (70). 또한 포스파틱산이 나 라이소포스파틱 산에 의해서 이 채널이 활성화되며, 세포 바깥에 Ca 양 이 존재하지 않더라도 이들 지질에 의해서 활성화되지만 Ca2• 킬레이터인 BAPTA(bis ( o- amino -p h enocy ) -eth a ne N, N, N', N'-te t r aa ceti c ac i d) 를 세포 내에 넣 어 주었을 때는 이들 지질에 의해서 이 채널이 활성화되지 않음을 보여 주었다 (71). 이는 이들 지질에 의해서 활성화되는 er 채널은 세포 외부 의 Ca2• 유입에 의해 활성화되는 것이 아니라 Ca2• 저장고의 Ca2• 동원 에 의해서 활성화되고 있음을 시사해 준다. 개구리 난세포에 존재하는 이 er 채널의 cDNA 가 최근 밝혀졌는데 13 개의 막 관통 부위를 가진 805 아미노산으로 구성되어 있는 것으로 알려지고 있으며 이 채널의 연 구가 다양하게 이루어지고 있다 (72).

6-4 신호 전달 기작 앞에서 살펴본 여러 장을 통해서 이미 언급한 것처럼 외부 신호가 그 수용체에 결합 하면 세포막 효소에 의해 제 2 의 전령이 생성되고 그 다 음 세 포 반옹이 일어나는 경로로 신호가 전달된다 . 이때 수용체와 막 효 소를 연결하는 단백질이 G- 단백질이댜 여기에 관여하는 G - 단백질은 3 개의 소단위체 (a, B, Y) 로 구성되는데, 이들의 목적은 아데닐레이트 시 클라제 와 같은 세 포 막 효소를 활 성화시키는 것이다. G- 단백질은 이종 삼량체 로 구 성된 큰 G - 단백질과 큰 G - 단백질의 a 소단위체와 동질성 을 갖고 있 는 하나의 폴 리펩티 드로 되어 있는 작은 G- 단백질이 있다 . 최근에 이 들 G ― 단백질들이 세포막 효소에 관여할 뿐 아니라 이온 채널 도 조절하고 있는 것으로 알려졌다. 따라서 저자는 G- 단백질을 중심으 로 어떻게 이온 채 널 이 조절되고 있는지에 관해서 알아보고자 한다. 6-4- 1 작은 G- 단백질에 의한 이온 채널의 조절 Ras p 21 으로 대표되는 작은 G- 단백질은 자체가 GTPase 활성도를 갖 는 데, 큰 G - 단백질과 마찬가지로 GTP 가 결합되면 활성화되며, 활성화된 ras 가 Ra f 를 활성화시키고 활성화된 Raf는 MEK(MAP 키나제)를 인산화 시킴으로써 활성화시키며, 이 활성화된 MEK 에 의해서 MAP 키나제 [유 사 분열 인자(mit o g en) 에 의해 활성화되는 단백질 키나제]가 안산화됨으로 써 활성화되어 이 효소가 핵 내의 전사 요소들을 활성화시킨다. 따라서 ras 와 같은 작은 G- 단백질에 의한 신호 전달 기작은 종양 유전자의 생 성, 변형 등과 같은 성장 인자와 관련되어 있는 세포 반응에 많이 관계 하는 것으로 알려져 있다. 최근에 이 Ras G- 단백질에 의해서 채널이 조 절되고 있음이 밝혀졌다. 아세틸콜린에 의해 활성화되는 K+ 채널이 ros p2 1 단백질에 의해 억제되고 있음이 보고되었다 (73) . 이 억제 효과는 ros

뿐만 아니라 GTPase 를 활성화시키는 단백질 (GAP) 을 동 시에 필 요로 하 는데, 비가수분해 G- 단백질 활성 인자인 GTPrS 가 이 채 널을 활 성화시 키고 있을 때에는 억제 효과가 없었다. 이 채널의 활성화는 아세틸 콜린 이 그 수용체에 결합하면 큰 G - 단백질이 활성화되어 이루어지 는 데 , 이 반응을 억제하는 데 관여하는 ras 및 GAP 는 아마도 수용체와 큰 G - 단 백질 사이에서 작용할 것으로 여겨진다. 그러나 이러한 전 과가 어떠한 생리학적 의미를 지니고 있는지에 대해서는 아직까지 밝혀지지 않고 있 다. 현재로서는 ras-GAP 에 의해서 K 채널이 조절되고 있는 점뿐만 아 니라 서로 다른 G- 단백질(큰 것과 작은 것)에 의해서 이루어지는 경로가 서로 작용하고 있다는 사실은 매우 홍미로운 일아다. 최근에는 생체막의 탈분극화와 Ca2’ 유입 (L- 형의 Ca 2 令 채널)에 의해서 MAP 키나제 경로를 활성화시키고 있음이 밝혀졌다 (76). 일반적으로 PC12 세포에서 ras 의 활성화는 NGF( 신경 성장 인자, nerve gro w th fa c t or) 에 의해서 이루어지는 것으로 알려져 있는데, 생체막의 탈분극화 에 따른 L- 형의 Ca2+ 채널의 활성화에 의해서도 ras 가 활성화되고 있음 을 의미한다. 그러나 Ca2+ 유입에 의한 ras 활성화는 NGF 에 의해 활 성 화되는 경로와는 구분되는 것으로 알려졌다. 왜냐하면 L - 형의 채널 억 제제인 nifedipin e 이나 EGTA 에 의해서 M 사) 키나제의 활성도나 MEK 의 활성도, 그리고 ras 의 활성도가 억제되었는 데 비해 NGF 에 의해 활성화 된 이들 활성도를 이들 시약은 억제하지 못했다 (76). 아직까지 그 기작은 명확하지 않지만 Ca2+ 유입이 GEF( 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자, gu a- nine nucleoti de exchang e fa c to r) 를 활성 화시 킴 으로써 ras 의 GDP 를 GTP 로 바꿔 주는 단계에 관여하거나 GAP 를 억제하는 반응에 관여할 것으 로 여겨진다. 비록 그 기작은 아직 확실하지 않지만, L- 형의 Ca2+ 채널 에 의해서 MAP 키나제 경로가 활성화되고 있음은 앞에서 살펴본 이온 채널에 의해서 ras 의 활성화가 억제되고 있는 결과와 함께 의의가 있으 며 앞으로 계속되는 연구가 채널과 ras 에 의한 MAP 키나제 경로와의

관계 를 명 확 히 밝혀 줄 것 으 로 기 대된다 .

6-4-2 이종 삼량체의 G_ 단백질 (he t ero t r i mer i c G- p ro t e i n) 에 의한 이온 채널의 조절

다양 한 G ― 단백 질둘 이 다양한 경로 를 통하여 이온 채널을 조 절 한다는 사 실 이 밝 혀 진 바 있다. 또 한 이러한 다양한 경로의 존 재가 당연한 것으 로 여 겨지는 것은 무 리가 아니다. 왜냐하면 지금까지 밝혀진 바에 의하 면 최소 한 40 개의 다 른 활 성제 , 70 개의 수용체, 15 개의 서로 다른 G- 단 백 질 , 약 100 여 개의 단백 질 키나제, 그리고 수백 개의 이온 채널이 존재 함이 밝 혀 졌 는데 (77) , 하나의 수 용체가 한 개 이상의 G- 단백질과 작용하 고 , 하나의 G - 단백 질 이 서 로 다 른 이온 채널과 작용하기도(예 를 들어 Gs 는 Ca 2’ 채널 뿐만 아니라 Na· 채널 도 조절한다) 한다. G - 단백 질 은 간접적으로 이온 채널을 조절할 뿐 아니라 직접 이온 채 널을 조절 하기도 한댜 전압 - 의 존 성 Ca2+ 채널이 G- 단백질에 의해서 직 접 조절 되고 있음이 보고되었다 (74). 또한 G - 단백질에 의해 활성화된 포 스포 리파제 A 에 의해 생성된 아라키돈산 (arac hi do ni c ac i d) 에 의해서 이 온 채 널 이 조절되는 간접적인 경우도 있다 (75). 그림 6 - 11 에서 보는 바 와 같 이 G - 단백질에 의한 이온 채널의 조절에 관여하는 경로를 크게 4 가지로 나누어 생각할 수 있다. 먼저, G- 단백질이 직접 이온 채널을 조 절하는 경로를 고려할 수 있을 것이다(® 一 @ - @). 두번째로 G- 단 백질이 생체막에 존재하는 효소(예 를 들어 아데닐레이트 시클라제, ． 포스포 리파제 C) 를 활성화시킴으로써 생성된 제 2 의 전령에 의해서 이온 채널 이 조절되는 경우이다(® 一 ® 一 ® 一 @ -@ ). 다음으로 고려될 수 있는 경로는 앞에서 언급한 아라키돈산에 의해 조절되는 경우처럼 G- 단 백질에 의해 활성화된 효소가 제 2 의 전령을 생성하고 다시 제 3 의 전 령이 생성됨으로써 이에 의해 이온 채널이 조절되는 경우이다(® 一 ®

I. G- 단백질에 의해 직접 조전받는 경로

一 ® 一 ® 국 5 一 ®). 끝으로 G- 단백질이 직접 또는 간접적인 경로와 함께 이온 채널을 조절하는 경우가 있다(® 一 @ 一 ®과 ® 一 @ 一 ® 一 @ 一 ® 一 ® 또는 CD - @ - ® - @ - @). 앞에서 언급한 것처럼 G- 단백질과 이온 채널의 조절에 관여하는 경로 는 매우 다양하고 복잡하기 때문에 이들 네 가지 경우로 나누어서 G - 단 백질에 의해 조절되는 이온 채널에 관여하는 신호 전달 경로를 살펴보 기로한댜 G- 단백질에 의해 직접 조절되는 이온 채널의 대표적인 예로서 아세틸 콜린 수용체에 의해 활성화된 G- 단백질(G. 또는 G) 에 의해 조절되는 K 채널을 들 수 있다 (78). 척추동물의 심장 세포에 있는 Ca2+ 채널의 경 우도 G- 단백질에 의해 직접 활성화된다 (78). 이외에도 G- 단백질에 의해

직접 이온 채 널 이 조절 되 는 경우 는 신경 세 포, 근 육 세포뿐만 아니라 많 은 세 포 에서 발견 되었다 ( 8 0) . 이 들 의 확 인은 재구성 실험 방법에 의해 수행되 는 데, 즉 분 리 정 제한 G - 단백 질 또는 a - 소단위체와 이온 채널을 지 진 이 중구조 를 가 진 인공막이나 분리한 막에 넣은 후, G- 단백질과 이 온 채 널 과의 상 호작 용 을 알아 볼 수 있다. 제 2 의 전령융 통 해 간 접 적으 로 G - 단백질의 영향을 받는 이온 채널로 서 망막 세 포 ( r e ti n a l c e ll) 에 있 는 양이온 채널이 대표적인 경우이다. 광 수용 체인 로돔신은 광 자에 의해 활 성화되는데 이 활 성화된 로돕신은 G- 단백 질 (G1) 을 활 성화시키며, 활 성화된 G t 는 포 스포디에스터라제 (PDE) 를 활 성화시켜 세 포질 내 c G MP의 양을 조 절 함으로써 Na+ 채널을 조절하는 것 이다 ( 8 1) . 또다 른 예 로 서 노르 에피네프린 (nore pi ne phri ne) 은 8 - 아드레 너 직 수용체에 결 합하는데, 이때 G- 단백질 (G s ) 이 활성화된다. 이 G s 의 a 소단 위체 는 아데 닐 레이트 시 클 라제를 활성화시키며 cAMP 를 생성하 면 Ca 언 채 널을 조 절 하게 된다 ( 81) . 또 다른 G- 단백질에 의해 조절되는 이 온 채 널로 서 앞에서 언급한 PLA 2 에 의해 생성된 아라키돈산에 의해 활 성화되 는 경우이다 . 만약 제 2 의 전령인 cAlvIP, cGMP, 또는 다른 물 질 이 단백질 키나제 를 조절함으로써 이온 수송을 조절하는 경우도 여기 에 해 당된다 (81, 82). 끝으로 단백질에 의해 직접 이온 채널이 조절될 뿐만 아니라 제 2 의 전령이나 제 3 의 전령에 의해서도 동시에 조절 받는 경우가 있다. B- 아들레날린 수용체에 의해 활 성화되는 G s 는 직접 Ca2+ 채널(8.3)과 Na+ 채널 (84) 을 조절하는데, 동시에 G s 에 의해 활성화된 아데닐레이트 시클 라제에 의해 생성된 제 2 의 전령 (cAMP) 이나 제 3 의 전령에 의해서도 이돌 채널들이 조절되고 있다. 무스카린 수용체는 G i나 Go 와 결합함으로 써 심장 세포의 이온 채널을 직접 조절할 뿐만 아니라 cAMP 및 PKA 로 이어지는 경로에 의해서도 조절되고 있다(8.5).

6-4- 3 G- 단백질의 /3, y 소단위체에 의한 이온 채널의 조절 Log o th e ti s( 86) 등은 소의 대뇌 피질로부터 분리 정제한 G - 단백질을 병 아리 배의 심방 세포 (c hi ck embry o nic atr ial cell) 에 접맥시켜 무스카린 에 의해 활성화되는 K 채널을 확인하였는데, 이때 G - 단백질의 a 三 소단 위체 에 의해 활성화된 것이 아니라 B y 소단위체가 아세 틸콜린 에 의해 활성 화되는 K 채널을 간접 적으로 조절하고 있음이 보고되었다 (87). 이 는 f3 r 소단위체에 의해서 PL A.z가 활성화되는데 활성화된 PLA 哀근 아라키돈 산을 생성하며 이 아라키돈산은 리폭시게나제Oipo x yg enase) 에 의해 HETE 유도체가 만들어지거나, 시클로옥시게나제 (c y cloox yg enas e) 에 의 해 HEPE 유도체 또는 프로스타클란딘(p ros t a g lan di n) 을 생성하게 된다. 시클로옥시게나제에 의해 생성된 프로스타글란딘은 이 K+ 채널에 아무 런 영향을 미치지 않았지만 리폭시게나제에 의해 생성된 HETE 유도체 에 의해서 K 채널이 활성화되고 있음을 보여주었댜 이외에도 /3 r 소 단위체에 의해서 이온 채널이 조절 되고 있음이 여러 세포에서 발견되 었다 (75, 88, 89). 일반적으로 B r 소단위체의 이온 채널에 대한 역할에 대해서는 아직 불확실한 상태로 남아 있다. 왜냐하면, 비록 8 r 소단위 체에 의해 PLA2 의 대사 물질인 HETE 유도체에 의해 K 채널이 조절되 었지만, 무스카린이나 다른 활성제에 유도되는 K+ 채널을 조절하는 반응 에는 아무런 영향을 미치지 못했다. 6-4- 4 Ga 소단위체와 이온 채널과의 작용 기작 S盧 e r K• 채널의 N- 말단(세포질 부위)으로부터 20 개의 아미노산이 열려져 있는 K 채널을 비활성화시키는 것으로 알려져 있는데, 죽 이 20 개의 아미노산으로 구성된 펩티드가 K+ 채널의 구멍과 작용함으로써 K+ 채널이 닫히는 것으로 생각된다 (90). 심방 세포의 무스카린 K 채널은

활성화된 G - 단백질 (G aK) 에 의해 열리는 것으로 알려져 있다. 만약 앞에 서 살펴본 20 개의 아미노산으로 구성된 펩티드(비활성 펩티드)가 채널을 닫히게 하는 역할을 한다면, 이 비활성 펩티드가 제거되었을 때 K 채널 은 열린 상태 를 유지할 것 이다 . 이러한 가정 아래 Ki rsch 와 Brown(91) 은 트립신을 사용하여 K' 채널을 활성화시켰댜 그러나 열에 의해 변성된 트립신 이나 트립 신 억제제 를 동시에 넣어 주었을 때에는 그 활성화 효 과가 없었다. 트립 신 또한 G - 단백질에 의한 K 채널 활성을 억제하였댜 트립신은 단백질의 시스테인이나 아 르 기닌 잔기를 끊어주는데, 아르기닌 과 특 이하게 반응하 는 시약인 글리옥살(g l y oxal) 이나 페닐글리옥살(p he­ n y l g l y oxal) 은 K' 체 널을 활 성화시키지 못했댜 이 실험 결과는 G- 단백 질과 이온 채 널 의 작용 메커니즘에 대해서 간접적으로 설명하고 있다. 즉, G a K 가 존 재하지 않을 때 이 채널이 닫혀져 있는데, 이때 비활성 펩 티 드가 이 채널의 구멍 영역과 작용하고 있다. 그러나 활성화된 GaK 가 이 비 활성 펩티드와 작용하거나 또는 비활성 펩티드가 채널의 구멍 영 역과 작용하는 것을 억제함으로써 채널을 활성화시키는 것으로 여겨진 댜 아울러 세포의 내부에 촌재하며 트립신에 의해 끊어질 수 있는 리신 이 존 재하는 (Shaker K. 채널의 경우 10 번째 Ly s) 부위가 채널을 억제하 며 동시에 G- 단백질과 작용할 가능성을 시사해 준다. 그 동안 이온 채널의 중요성에 비해서 연구가 활발히 진행되지 못한 것은 사실이다. 그러나 최근에 상당히 많은 생명 과학 분야에서 다각도 로 연구되고 있다. 채널의 활동 메커니즘에서부터 그것을 조절하는 전달 메커니즘에 이르기까지 많은 결과들이 발표되고 있다 . 최근에는 종양 유 전자 생성으로 대표되는 MAP 키나제 경로도 채널과 상호작용하고 있음 이 보고되었다. 그러나 많은 연구들이 전기 생리학 측면에서, 그리고 그 조절 경로를 밝히는 신호 전달 체계에 집중되고 있다. 생리학적 또는 생 화학적인 측면에서 여러 연구가 진행되고 있음에도 불구하고 아직까지 는 채널의 열리고 닫히는 정확한 기작이 불확실하며, 이온 채널을 조절

하는 경로 각 단계에 존재하는 단백질이나 여러 요인 들 의 생화학적 규 명도 앞으로 해결되어야 할 과제라 여겨진다. 그러나 채널의 다양성이나 조절 기작의 복잡성을 고려해 볼 때, 진행되고 있는 연구에 대해 희망적 이라 하지 않을 수 없다. 채널 단백질의 구조와 기능 , 이 들 채 널 의 이온 선택성에 함유된 기작, 많은 억제제에 의해 채널이 연구되어 오고 있 는 데 억제 기작은 어느 정도 알려져 있지만 개폐 기작, 그 리고 진화직인 측면에서 그 채널의 기원에 이르기까지 이 들 문제가 해 깅 되어야 합 과 제들이다 . 생화학 및 생물학적 연구가 이 들 문제 해 결 에 근 원적인 역할 을 담당하고 있으며, 분자, 세포 및 진화적인 접 근 또한 이온 채널의 넓 고도 다양한 중요성의 해결에 기여할 것으로 기대된다 . 참고문헌 1) Albert s, B., Bray, D., Lew is, J., Raff, M., Robert s, K. and Wats o n, ]. D. (19 94). Molecular Bio l og y of the Cell Garland Publis h i ng Inc. N.Y . and London p 507 2) Hille, B. (19 92) Ion ic Channels of Exc itab le Membranes 2nd. ed. Sin a uer Associa t e s Inc. Sunderland, Mass 3) Neher, E. and Sakmann, B. (19 92) Scie n ti fic Ameri ca n, March, p 44 4) Unw in, N. (1993) J Mo!. Bio l. 229. 1101 5) Herz, ]. M., Joh nson, D. A and Tayl e r, P. (19 89) J Bi ol. Chem 264. 12439 6) Hu ganir, R. L. and Greeng a rd, P. (1990) Neuron 5, 55.5 7) Froehner, S. C. (19 91) J Cell Bi ol. 114, 1 8) Unw in, N. (1989) Neuron 3, fi65 9) Unw in, N. (1993) Cell 72 (sup pl.) 31

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제 7 장 신호 전이와 유전자 발현 유전자는 특정 단백질을 발현할 수 있는 정보를 담고 있으나 많은 유 전자가 동시에 발현되는 것이 아니고 외부 환경이나 내부 환경(신호 전 이 기작)에 의해 각 유전자의 발현이 조절되고 있다. 유전자 발현은 외부 환경 인자 들 에 의한 다양한 기작에 의하여 폴리펩티드가 발현되는 과정 이 복잡하게 조절되고 있음이 보고되어 있고, 원핵 세포와 진핵 세포는 각기 다른 조절 기작을 가지고 있음이 보고되어 있다 . 원핵 세포에서 유 전자 발현의 조절이 이루어지는 단계 중 하나의 예로 오페론설 (o pe ron t heo ry)을 들 수 있다. 오페론설에 의하면 유전자는 구조 유전자 (s tru c­ tural ge ne), 조절 유전자 (re gul a t o ry ge ne) 그리 고 작동 유전자 (o pe ra t or g ene) 로 구성되어 있는데, 단백질을 만들기 위한 유전 정보를 갖고 있는 유전자는 구조 유전자이고 이 구조 유전자 앞에는 작동 유전자가 존재 한다 . 작동 유전자는 단백질을 합성하게 하거나 또는 억제하게 하는 스 위치의 기능을 하고 있다. 조절 유전자는 작동 유전자의 작용을 억제하 는 억 제 물질 (re p ressor) 을 만든다. 유도 물질(in ducer) 은 조절 유전자가 만든 억제 단백질과 결합하여 유도 물질-억제 물질 복합체를 만들어 억 제 단백질이 작동 유전자의 억제 활동을 못하게 하여 구조 유전자는 유

전사방향

전자 발현을 할 수 있게 된다(그림 7-1). 유전자는 폴리펩티드 한 개를 발현하는 데 필요한 유전 정보를 의미 한댜 대장균에는 3000-4000 개의 유전자가 한 개의 DNA 에 배치되어 있 댜 이 모든 유전자들은 동시에 모두 mRNA 로 전사되는 것이 아니라 조 건에 따라 한 개의 유전자 (mono g en i c mRNA) 나 또는 여러 개의 유전자 가 동시에 rnRNA(po ly g e nic rnRNA) 로 전사된다 대장균은 포도당 배지 에서 배양하면 /3 - g alac t os i dase 를 발현시키지 못하므로 젖당을 분해하 지 못하나 배지에 탄소원으로 젖당을 첨가하면 젖당 분해 효소인 /3- g alac t os i dase 를 만들어 젖당 Oac t ose) 을 과당(g alac t ose) 과 포도당으로 분 해하여 에너지원으로 사용한다. 효소의 생성을 유도한 젖당을 유도 물질 이 라 하며 이 러 한 현상을 효소 유도 (en zym e i nduc ti on) 라고 한다. 한편 대장균은 트립토판을 합성할 수 있는 효소가 있어 대장균을 배양할 때 트립토판을 주지 않아도 성장할 수 있다. 그러나 배지에 트립토판을 넣어 주면 트립토판 합성 효소가 만들어지지 않는데, 이때 트립토판을 억제 물 질이라 하고 트립토판 합성 효소 (T rp s ynth e t ase) 와 같이 유전자 억제가 일어나 합성이 억제되는 것을 효소 억제 (e nzym e re p ress i on) 라고 한다. 고등 동물과 식물에서 단백질 발현의 조절은 훨씬 복잡할 뿐 아니라 박 테리아에서의 조절과는 다르다. 고등 생물의 유전자 DNA 는 원핵 세포와 는 달리 히스톤(hi s t one) 이 함께 있다. 염기성 단백질인 히스톤은 다섯 종 류가 있는데 종이나 세포의 종류에 관계없이 유사하다. 히스톤 중 DNA 를 둘러싸고 있는 것이 유전자의 작용을 억제하는 역할을 하고 있다. 유전자 발현은 생명체가 정상적인 생명 활동을 영위하기 위하여 정교 하게 조절되어야 한다. 유전자 발현의 촉진 또는 억제는 세포 의부의 신 호들에 의하여 조절된다. 세포의 성장을 촉진하는 인자로 표피 성장 인 자, 혈소판 유도 성장 인자, 섬유 아세포 성장 인자 둥이 있고, 성장을 억제하는 인자로는 형질 전환 성장 인자(tran s forming growth fac to r - /3, TGF-/3 ), 인터페론, 종양 회사 인자(turn ornecros i s fac to r , TNF) 동이 있

댜 성장 인자가 원형질막에 있는 수용체에 결합되면 세포 내 단백질들 과 2 차 전령들의 단계적인 활성에 의해 세포 성장이 일어난다. 성장 인 자 수용체가 활성화되면 여러 효소들의 활성도가 증가되며 2 차 전령둘 을 만들어 낸댜 2 차 전령들은 단백질 인산화 효소(단백질 키나제)등을 활성화시키며 이 신호는 핵 내의 전사 조절 인자(tr ansc ripti on fa c t or) 를 인산화 등의 방법으로 조절한다. 이러한 조절 과정을 통해 DNA 복제 및 세포 분열의 세포 주기 진행에 관련된 유전자 발현이 유도되고 세포 는 증식을 하게 된댜 한편 세포 성장을 억제하는 인자 들 이나 세포간의 접착 등에 의해서는 세포의 증식이 억제된다. 세포 성장시 신호 전달에 관련된 단백질들의 활 성화와 비활성화와의 균형이 깨지면 특정 단백질들의 영구적인 활성화 또는 비활성화가 유발 되어 세포는 정상 활동을 벗어나게 된다. 특정 단백질의 이상은 유전자 의 변화(poi n t 돌연변이, 유전자 증폭, 유전자 재배열 삭제)에 의해 발생되 는데 암 발생에 관련된 유전자를 종양 유전자 (onco g ene), 암 억제에 관 련된 유전자를 종양 억제 유전자(tum or sup pre ssor g ene) 라 한댜 Proto - onco g ene 과 종양 억제 유전자가 세포의 신호 전달 과정과 이에 의한 세 포 주기에 관련된 유전자임이 밝혀지면서 세포의 암 발생이 신호 전달 체계의 이상에 의하여 이루어진다는 사실이 명백해지고 있다. 앞에서 기술한 바와 같이 세포 내 유전자 발현은 크게 구분하여 신호 전이(그림 7-2) 단계와 전사(그림 7-3) 단계에서 조절될 가능성이 있는 것으로 알려져 있다. 본 장에서는 신호 전이 과정이 유전자 발현에 미치는 영향과 전사 과 정에서의 유전자 조절을 다루려고 한다. 그러나 아직까지 특정 유전자 발현과 관련하여 신호 전이 과정이 완전하게 밝혀진 예는 찾아보기 힘 든 형편이다. 그러므로 본 장에서는 신호 전이의 특정한 일부 단계와 유 전자 발현과의 관계를 논하고자 한다.

외부XR cAMP 뮴 조 절 하는 Ca2+ 물 동원하는 성장인자

7-1 진핵생물의 신호 전이 및 유전자 발현 7-1-1 아메바 발생 과정에서 유전자 조절 사회성 아메바 (soc i al amoeba, Di cytos te l iu m di sco i deum) 는 세포와 세 포 사이의 신호에 의해 세포 분화와 유전자 발현이 조절되고 있음이 비 교적 잘 알려져 있다 (1-6). 아메바의 발생 과정 중 나타나는 유전자 발 현 현상은 지난 수 십년간 연구되었다 . 먼저 생화학적 또는 면역학적 연

( 1 차 전사 )

구 방법 들로 발생 을 조 절 하는 효소와 항원을 밝혀 냈고, 2- D SDS— PAGE 로 발생 과 정 중 단백 질 합성의 변화 형태 를 분석할 수 있었다. 현재 발 생 과 정 에서 조절 되 는 많은 유전자들이 클론되어 있으며 이들 유 전 자 발 현 을 조절 하 는 인자 들 이 연구되고 있다 . 이 들 연구를 요약하면 cAMP 와 호르몬은 유 전 자 발현을 위해 중요한 역 할 을 하는 것으로 나타 나 있댜 아메바 는 단식 (s ta rva ti on) 에 의해 발생 과정에서 특정한 유전자의 발 현이 감소 되 는 반면 dis c o id in I, a- m annosid a se, cAMP 포스포디에스터 라제 (PDE ) 억제제 I 의 유전자 들 은 발현이 증가된다 (l) ． 이들 유전자 발 현 은 분 비 물질 (PSF , CMF) 이나 아미노산의 결핍 등에 의해 유도된다. 그러나 이러한 유전자 발현은 일시적이며 대부분 cAMP 에 의해 유전자 발현 이 유 도 된다. 한편 다 른 종류의 유전자 (cAMP 수용체, 시클릭 뉴클레 오티 드 PDE, adhe si v e co n ta c t sit es A, G- 단백질 a 소단위체)들이 4 시간 동 안의 단 식에 의해 발현이 증가되었다 (2) . 단식 세포 (s tarv ed cell) 에서 이 들 응 집 성 유전자 (a gg re g a ti v e g ene) 들의 발현은 일정한 수준의 cAMP 가 미리 첨 가된 배지에서는 영향을 받지 않았으나 수 nM 수준의 cAMP 펄스 (p ulse) 에 의해서는 유전자 발현이 유도되었다 . 응집이 이루어지는 동안 세번째 유형의 유전자 (C y s 단백질 분해 효소 , ras p ro t oonco g enes) 들 이 pre sta lk 영역에서 우선적으로 발현되었다 . 이들 p res talk에 풍부한 유 전자들은 외부에서 첨가해 준 cAMP 에 의해 발현이 증가되었다 (3). 응집이 형성된 후 응집성 유전자의 발현은 감소되고 비특이적인 유전 자 즉, spo r e-sp ecific 유전자들이 발현되 었으며 이 들 유전자의 mRNA 는 수 µM 의 cAMP 에 의해 다시 증가되었다 (4). 또한 ecm A 와 ecm B 와 같은 sta lk- sp e cific 유전자들이 응집이 형성되는 동안 전사되었다 (5). 이 유전자들의 발현은 DIF(d iffer enti at i on ind ucin g fac t or) 에 의 해 유도되 었 으며 DIF 에 의 해 유도된 sta lk 세포 분화와 sta lk-s p ecific 유전자 발현 은 암모니아나 cAMP 에 의해 억제되었다 (6). 이와 같이 세포 밖에 존재

하는 암모니아 또는 cA l\1P , 아데노신의 양은 아매바의 유전자 발현 의 조절자로서의 역할을 하고 있다. 7-1-2 세포 의부의 cAMP 수 µM 수준의 cAl\ 1P 를 사용한 농도 의 존성 연 구로 아매바의 발생 과정에서 pos ta g g re ga tiv e 유전자가 발현되고 있음이 관찰되었다 (7). 변 형된 cAMP 유도체를 이용하여 여러 종류의 세포에 존재 하 는 cAMP 수 용체의 뉴클레오티드 결합 특이성을 연구한 결과 비 슷한 양상 을 보였으 나 세포질 내 cAMP 결합 단백질인 PKA 와 cABPl(cAMP- bin d i ng pro te i n 1) 에서는 결합 특이성이 구별되었다 . 이러한 결 과 들은 유전자 조 절이나 신호의 막 투과에 cAMP 가 강력한 첫번째 전달자(frr s t messen- ge r) 임 을 보여 주고 있다. 응집과 관련된 유전자 발현은 수 nM 의 cAMP 펄스와 같은 주화 성 (chemota xis) 신호에 의해 유도되며 이와 같은 신호는 주화성의 cAMP 수용체에 의해 인지된다. 그러나 몇몇 보고들은 이러한 수용체의 존 재 를 부정하고 있다. 두 개의 cAMP 유사체 (8 - bromo_cAMP 와 N;_ mono- buty ryl cAMP) 가 cAMP 보다 10 배나 많은 양의 site A(csA ) 유전자 를 발 현시켰다. 이 cAMP 유사체는 cAMP 보다 수용체에 대한 상대적인 결합 이 약하댜 이러한 사실은 csA 유전자 발현이 다른 수용체에 의해 유도 되고 있음을 시사해 주고 있다 (8) . 아메바에서 세포 외부의 cAMP 는 1000 - 2000 개의 유전자 발현에 관련 되어 있다. 그러므로 여러 개의 수용체가 각기 다른 경로로 활성화되거 나 수용체에서 유전자까지의 신호 전달 과정이 각기 달라야 한다. 즉 cAMP, cGMP, DAG, lP3 또는 lP3 유도체, Ca2+ 또는 cAMP 에 의 해 유도 된 이온들이 세포 내 중간체(i n t erm edi a t or) 로 작용할 수 있다. cAMP 수 용체의 활성화에 의해 합성된 cAMP 는 유전자 조절을 위한 후보자로 작

용한댜 그러나 이 후보와 관련이 있는 2 차 전령은 더욱 세분화되어 있 으며 중 요한 역 할을 수행하고 있다. 수용체에 의해 증가된 아데닐레이트 시 클 라제의 활 성 도는 카페인 또는 cAMP ― 유도 pre sta l k 또는 cAMP 에 의해 유 도된 pre s po re 유전자에 의해 감소되었다. 이러한 결과는 아데닐 레이 트 시 클 라제의 활 성화가 이 들 유전자의 발현을 위해 요구되는 것은 아님 을 시사해 주고 있다. 7-2 고등 식물의 신호 전이 및 유전자 발현 빛에 의한 식물의 유전자 발현은 4 개의 광수용체(p ho t ochloro p h y ll­ ide , 피 토크롬 , 청색 광 수용체, UV— B 수용체)가 관여하는 것으로 알려져 있지만 적색광 수용체인 피토크롬 외에는 그 분자적 성질이 자세히 밝 혀진 바 없다(그림 7-4). 식물체의 발아, 생장, 개화, 결실 등의 광형태 형성(p ho t omo rp ho­ g en e s i s) 은 광 신호가 염색체의 휴면 유전자 발현을 유도함으로써 일어 난다(표 7-1). 한편 호르몬 등에 의해서도 유전자 발현이 조절되는데 이 는 신호 전이 단계와 밀접한 관계를 가지고 있다. 7-2-1 적색광과 유전자 Ri bu lose-1,5-bis p h osp ha t e Carboxy la se-Oxy ge nase(Rubis c o) Rub i sco 는 광합성에 관여하는 단백질로서 빛에 의해 합성이 조절된다. 이 단백질은 두 개의 소단위체 (rbc L, rbc S) 로 구성되어 있으며 각각 8 개의 소단위체가 모여 4 차 구조를 형성한다. 큰 소단위체는 엽록체 유전 자로 존재하며 작은 소단위체는 핵 게놈(g enome) 에서 다유전자 (rnul tig ene fami l y)로 존재한댜 두 소단위체의 유전자는 각기 다른 경로를 통해 발

Pr

현이 조절되며 큰 소단위체 유전자의 발현이 선행된다. 큰 소단위체의 발현은 작은 소단위체의 발현에 조절 인자로 작용하고 있음이 밝혀졌다. 즉 엽 록체 인자가 핵 유전자 발현을 조절하고 있다 (9) . rbc S 유전자는 적색광에 의해 전사가 18 배 증가되며 원적색광에 노 출되면 처음 상태로 환원된다 . 이러한 사실로부터 rbc S 유전자의 발현 은 피토크롬 이 관여하는 광 형태 형성임을 알 수 있다. 그러나 최근 청 색광 수용체에 의해서도 발현이 조절되고 있음이 보고되었다(1 0) . 빛에 의해 유전자가 발현되는 것들에는 5I-fla nking 광 조절 부위에 여러 종 류의 보존된 서열 (conserved s eq uence) 이 존재하며 여러 종류의 조절 인

표 7-1 광에 의해 조절되는 유전자 (9) 유전자 (조+절/-)작 용 cPhhryo tmo-e Bligluhe t UB- B rl6 + + pS lAl + + pS lA2 + + cfo III + + cn A + + rbcL + + pG 32 + + rbcS + + + CAB + PEP GPDH Phy toc h rome +/- Proto c h lorop hy lide + r 려 uc t ase Chalcone + +/- -/+ Sy n ta s e PAL + + 4CL + + 자가 있음이 보고되었다. 가장 잘 알려진 GT-1 인자는 GGRRAA 서열을 포함하는 다양한 종류의 GT-1 부위에 특이적으로 결합한다(그림 7-5). GT-1 부위는 여러 개가 중첩되어 나타나는데 완두 rbc S-3A 유전자 에는 5 개가 존재함이 알려져 있다. GT-1 부위의 일부를 삭제시키거나 치환시키면 광 조절 기능을 잃으며 GT-1 사량체를 -90 CaMV. 35 s 촉 진 유전자에 연결시키면 광 조절 기능을 갖는 것으로 보아 이 부위는 식물의 광 조절 부위임을 알 수 있다. GT-1 결합 부위와 유사한 염기 서열은 빛에 의하여 조절되는 다른 유전자에서도 발견되었다. Gr-1 결합 부 위에는 부위 II(GTGTGGITAATAG A), 부위 ll(ATCATTTTCACT) 가 있

2 3

으며 피토크롬에 의해 조절된다. 그러나 빛과는 무관하게 GT- 1 결합 부 위를 갖는 유전자도 발견되어 GT-1 이 일반적인 전사 요인일 가능성도 있다 (11). lig h t- h arvesti ng chlorop h y ll a/b(Cab) Cab 의 mRNA 는 적은 양의 적색광에 의해서도 증가되고 있음이 밝혀졌 다. 벼 의 CablR 촉진자에 존재하는 AGCTCACCCCAAGCTCA-C CAAG 라는 반복 배 열 (oc tam er repe at : OCT-R) 이 빛 에 의 한 cis - a cti ng 요소

라는 것이 돌연변이 실험을 통해 밝혀졌다 (13). 피토크롬 유전자 피토크 롬 유전자는 적색광에 의해 발현이 감소된다. 피토크롬 유전자 의 mRNA 전사율은 적색광에 의하여 급격히 줄어들며(1 4), 원적색광에 의해 쉽게 회복될 수 있다. 피토크롬 유전자의 5' 에는 GT- 1 부위 III, 부 위 IJ, G - 부위, AT- 1 결합 부위 등과 유사한 배열이 있음이 밝혀졌다. 앞에서 기술한 바와 같이 적색광이 유전자 발현 (rbc S, cab, phy)에 미치 는 영향은 비교적 잘 알려져 있지만 신호 전이 단계와 유전자 발현과의 관계는 아직도 더 연구되어야 할 과제로 남아 있다. 적색광과 신호 전이 피토크롬에 의한 신호 전이에 G - 단백질이 관련되어 있음이 최근 알려 졌다. 이 보고에 의하면 24 kDa 의 분자량을 가지는 이 G- 단백질이 콜레 라 독소에 의해 ADP 리보실화(ri bos y la ti on) 되었다. 또한 적색광에 의해 유도되는 클로로필 a/b_결합 (Cab) 유전자 발현의 증가와 피토크롬(phy) 유전자 발현의 감소가 콜레라 독소를 이용한 실험에서 관찰되었다(1 5). 그러나 아직까지 이 G- 단백질이 따 b 과 phy 유전자 발현에 직접적으로 관여한다는 증거는 얻지 못했다. 그 외에 피토크롬에 의한 신호 전이 과 정에 G- 단백질이 연관되어 있다는 몇몇 보고는 있지만 G- 단백질이 유 전자 발현에 기여하고 있다는 명백한 중거는 아직까지 얻지 못했다. 동물의 신호 전이에서 원형질막에 존재하는 PIP2 가 PLC 에 의해 분해 되어 lP3 와 DAG 가 생성된다는 것은 잘 알려진 사실이다. 식물에서도 이 러한 반응이 일어나고 있음이 보고되었다. 최근 보고에 의하면 옥수수 (Zea may s) 의 잎에서 PIP2 가 적색광에 의해 빠르게 증가되었다가 감소 되고 있음이 관찰되었다(1 6). 또한 lP3 가 피토크롬에 의한 반응과 관련이 있다는 간접적인 증거가 제시되었다. 그러나 아직까지 적색광에 의해 활

--r--_ , 『'., _.-, (b) --'gN - L'N- .-u L hsp 75

성화된 PI- 순환이 유전자 발현과 관련이 있는지 여부는 모르는 상태이 다. 피토크롬에 의한 신호 전이에 Ca 2· 이 중요한 역할을 하고 있다는 것은 잘 알려진 사실이다 . 세포질 내의 Ca2• 농도는 적색광에 의해 30nM 에서 51 nM 로 증가하였다(1 7). 한편 Chua 는 Ca2 누결합 단백질의 억제제(칼모 듈린 길항자)인 W-5, W-7 과 trifl uoro pe raz i ne 을 이용하여 광에 의한 세 포질 내 Ca2+ 농도 중가가 mb 과 hsp 7 5 유전자 발현에 미 치 는 영 향을 관 찰하였다. 그림 7-6 에서 보는 바와 같이

등에 의하면 칼슘 i ono p hore 인 A23187 이나 i onom y c i n 에 의해 cab 유전 자의 전사가 증가되는 결과를 보임으로써 Chua 의 결과를 재확인해 주고 있댜 단백질 인산화도 피토크롬에 의한 신호 전이에 중요한 단계임이 알려 졌댜 그러나 구체적으로 어떤 단백질의 인산화가 유전자 발현의 중요한 인자 로 작용할 것인지는 모르는 상태이다 . 귀리의 원형질체에 적생광을 조사하면 15 종 이상의 단백질의 인산화가 관찰되지만 그 중 2 개 단백질 (27, 32 kDa) 만이 피토크롬의 홉수 스펙트럼과 일치하는 작용 스펙트럼 (acti on s pect rum) 을 보여주고 있음이 알려졌다(1 9) . 그러나 이 단백질들 의 인산화가 유전자 발현과 구체적으로 어떤 관계가 있는지 여부는 모 르고 있다. 이와 같이 최근 피토크롬에 의한 신호 전이 현상의 연구에도 불구하고 신호 전이와 유전자 발현의 관계는 더 연구해야 할 과제로 남 아 있댜 7-2-2 청색광과 유전자 청색광 수용체와 신호 전이 고등 식물에서 청색광 수용체의 정체는 아직까지 명확하게 알려진 바 가 없다. 가능성이 있는 것으로 f3기베타카로틴과 리보플라빈을 들 수 있 댜 그러나 최근 청색광에 의해 조절되는 몇몇 신호 전이 현상이 발표되 었댜 이돌 보고에 의하면 첫째, 원형 질막에 존재하는 단백질의 인산화 가 관찰되었으며 (20), 둘째, 원형질막에 존재하는 G- 단백질의 GTPase 의 활성도가 변화하였고 (21), 셋째, 청색광에 의해 유전자 발현의 조절이 관 찰되었다 (22). 완두의 클로로필 a/b 단백질 (Cab) 유전자의 전사율이 청색 광에 의해 증가되었댜 완두의 빛에 의한 mRNA 생성량을 관찰하기 위 해 7 일 동안 적색광 하에서 키운 후 24 시간 동안 청색광을 조사하였다. 그 결과 청색광을 조사하지 않은 완두보다 청색광에 노출된 경우에 rbc

S 의 mRNA 가 6 배 증가하였댜 그러나 천연의 완두에서나 또 는 암실에 서 키운 완두의 경우 24 시간 청색광 조사에 의해 rbc S - 3A 나 rbc S- 3C 의 mR1 사 A 는 변화되지 않았다 (23). 이러한 현상은 적색광에 의해 유전자 가 조절된 후 청색광에 의해 재조절되고 있음을 시사해 주고 있다. 다섯 종류 이상의 피토크롬 존재 (24) 와 청색광에 의한 피토크 롬 의 영향은 청 색광/적색광 상호작용에 의한 유전자 조절 가능성을 높여 주고 있다. 이 러한 가능성은 다음과 같은 신호 전이의 존재 를 의미한다. ® 몇몇 청색 광에 의한 유전자 조절은 피토크롬의 활성도가 높아진 후 나타난다. @ 한 종류 또는 그 이상의 피토크롬종은 활성도가 높아지기 위해 청색광 수용체의 활성도가 높아져야 한다. ® 신호 전이 과정에 여러 경로가 존 재해야 한다. 그러나 이러한 가설을 확인하기 위해서는 좀더 많은 연구 가 요구된다. 지금까지 본 바와 같이 수용체에 신호가 인지된 후 휴면중 인 유전자까지 신호가 전달되기 위해서는 한 개 이상의 경로 를 사용할 수 있으며 동시에 여러 단계에서 유전자 조절을 할 가능성이 있으므로 완벽한 경로를 확인하는 작업은 앞으로 많은 연구가 필요하다 하겠다. C i s- 와 Trans-Acti n g 요소 청색광에 의해 조절되는 유전자의 촉진 유전자 연구가 cis - acti ng 요 소를 밝히기 위한 수단으로 수행되었고, tran s-acti ng 요소를 밝힐 수 있 는 가능성을 제공하였다. 돌연변이 식물인 Arabid o p s is t/-a l i ana 에서 CHS : GUS 의 5' 촉진 유전자를 연구하여 CHS 촉진 유전자의 523b p를 GUS 에 연결시 켰다 (25). 16 시 간 동안 빛을 조사하면 GUS 의 활성 도는 50% 중가되었다. 한편 48 시간 동안 빛을 조사하면 암실에서 자란 것보 다 활성도가 3-4 배 중가하였다. 촉진 유전자의 186b p를 제거하자 청색광 에 의해 유도되던 CHS 가 발현되지 않았다. CHS 유전자의 5' 부위는 다 른 모든 CHS 유전자에서도 발견되었고 대부분의 rbc S 촉진 유전자에 서도 발견되 었 다. 완두의 rbc S-3A 와 rbc S-3C 의 촉진 유전자를 제거 한

유전자 역시 광특이성 cis - a c ti ng 요소 를 연구하기 위해 사용되고 있지 만 아직까지 보고된 인자는 없는 상태이다. 7-2-3 Abscis i c a ci d 와 유전자 Absci si c acid ( ABA, 그림 7 - 7) 는 지금까지 발표되었던 식물 호르몬 중 에서 실용적으로 이용되지 않았던 유일한 화합물이다 . 식물체 내의 ABA 함량은 1 ppm 이하이며 낙엽의 형성, 휴면, 기공의 폐쇄 등 억제적 이며 가역적으로 작용하는 경우가 많다. Posit ive reg u lati o n ABA 에 의해 조절되는 몇 개의 유전자(E m, rab, De 3) 로부터 cis - acti ng 요소 (ABRE) 가 확인되었고 (26) DNA 의 cis - acti ng 요소에 결합하 는 tra ns-a cti ng 요소는 핵에 존재하는 단백질임이 보고되었다 (Zl). 몇몇 핵단백질이 특이적으로 ABRE 에 결합하고 있었는데 그 중 하나인 Em BP - 1 은 ABRE 가 가지고 있는 G-box 에 8 개 염기와 특이적으로 결합하 여 ABA 에 의해 조절되는 전사 활성화 안자로 작용하고 있음이 확인되 었다 ABA 에 의해 유도되는 많은 유전자들이 식물체를 성장시킬 수 있

OH

는 다른 자극(탈수 반응, 높은 삼투압, NaCl, 낮은 온도 그리고 열 자극) 들 에 의해서도 조절되고 있음이 밝혀졌다. 대부분의 경우 ABA 에 의해 조 절되는 유전자 발현은 ABA 의 양과 관계가 있댜 그러나 몇몇 유전자 들 마의 토발에현 존은재 앞 하에는서 AB열A거 에한 의다 :n른 유자도극되에 는 의유해전 자영(p향 L을E4 ,받 p지L E 1않6,고 p L있 E2다5) . 토발 현은 ABA 양과 항상 일정한 관계로 나타나지는 않는다 비 록 이 세 유 전자가 ABA 에 의해 발현되기는 하지만 ABA 양과 이 유전자의 mRNA 양과의 사이에 상관관계가 없는 것으로 보아 다 른 자 극 역시 유전자 발 현에 조절 인자로 참여하고 있음을 알 수 있다 (28 , 29). Neg a ti ve reg u lati on 몇몇 유전자들은 탈수 반응과 같은 자극 하에서도 ABA 에 의해 발현 이 증가되었댜 그러나 유전자 발현이 감소되는 예도 밝혀졌다. 광합성에 필요한 유전자 (cab, rbc S) 들은 탈수 반응과 ABA 에 의 해 발현이 감소되 었다 (30, 31 ). 또 다른 경우로서 ABA 는 GA3( gi bbere lli n) 에 의해 유도되 는 유전자 발현을 감소시켰다. 이상에서 본 바와 같이 유전자의 발현은 한 개 이상의 단계에서 복잡하게 관여하고 있음을 알 수 있다. 7-3 암과 유전자 발현 생명체의 정상적인 세포 활동은 의부 환경에 잘 적응하기 위해서 정 교하게 조절되고 있다. 세포의 성장과 증식은 증식을 유발하는 암 유전 자 (onco g ene, 표 7-2) 와 중식을 억제하는 종양 억제 유전자(tum or sup pre ssor ge ne) 사이의 균형에 의해 조절된다. 세포의 성장을 촉진하는 인자로는 EGF, PDGF, FGF 둥이 있고 성장 울 억 제 하는 인자로는 TGF-/3 (tran sfo rming grow th fac to r -/3 ), 인 터 페

표 7-2 종 양 유 전 자 Onc og e n e Prot o (- w o hn ceo reg ekn n eo wF unn) c ti on SoVu ri crue s of Vi ruT s u-m in do ur ced ab/ pro te in kin a s c( ty ro s in e ) mo u s e pre - B - c ell leu kem ia cat sa rco m a ak( ? mo u s e T- c e ll lym p ho ma erk ac ti va to r of tyr o s in e -sp ecific chic k e n sa rcoma pro te in kina s e(s ) erb - A thy ro id ho n no n e rec ep tor chic k e n (su p ple ments acti on of v- e rb- B ) erb - B pro te in kin a se (tyro s in e ). chic k e n ery thro leu ke m ia: ep id e rm a l gro wt h fac to r (E GF) fibr os a rcoma rec ep tor ets nuclea r pro te i n chic k e n (su p ple ments acti on of v- m yb) fes / f p s pro te in kina s c( ty ro s in e ) ca t /ch ic k e n sa rco m a fgr pro te in kina s e( ty ro s in e ) cat sa rcoma fm s pro te i n l

성장인자

론, TNF(tu mo mecrosis fac to r, 종 양 회사 인자) 등이 보고되 었다. 정상 세 포는 ® 세포 주기의 이상, ® 신호 전이 경로의 이상, ® 암 유전자의 활성화 등에 의해 암세포로 전환되나 여기에서는 주로 신호 전이와 암 과의 관계(그림 7-8) 를 다루고자 한다.

7-3-1 수용체 수용체 는 각기 다른 세 가지 방법으로 수용체에 인지된 의부 신호를 첫번째 분자에 전달한다 . ® 채널과 연결되어 있는 수용체는 신경 전달 물질 과 관련된 신호 전이에서 보이는 형 태로 신경 전달 물질 - 의존성 이 온 채 널 의 문을 열거나 닫는다. ® 촉매 기능을 가진 수용체는 주로 티 로신 -특 이성 단백 질 (T y r - s pe c ifi c p ro t e i n) 이며 목표 단백질의 티로신을 직접 인산화시킨다 ® G - 단백질과 연결되어 있는 수용체는 G- 단백질을 활성화시킨 후 이 단백질에 의해 원형질막에 결합되어 있는 효소나 이 온 채널이 활 성화된다 . 세포의 성장 조절에서 자극이 세포 표면의 수용 체에 의해 인지된 후 이 신호는 일련의 세포 내 신호 전이 과정을 거쳐 핵 내의 유전자까지 전달되며 이 과정에서 세포 내에 존재하는 물질의 변화 및 새로운 물질의 생산으로 자극에 의한 세포 반응을 하게 된다 . 암과 관련하여 지 금까지 보고된 수용체는 ros, erbB, c-er bB-2, fins, met, trk , sea, kit , ret 등이 있으며 주로 촉매 기능을 가진 수용체 (cata l yt ic rece pt or) 에 속한댜 성장 인자의 수용체는 세포 외부 영역, 막 관통 영역, 세포질의 키나제 영역으로 구성되어 있으며 신호의 전달을 위하여 목표 단백질을 인산화한다. 수용체의 자동 인산화된 티로신은 목 표 단백질의 SH2(src) 영역과 결합함으로써 신호가 전달되며 활성화된 수용체와 결합하여 인산화되는 목표 단백질로는 포스포리파제 C-r, ras-GTPase 활성 단백질 (ac ti va ting pro te i n ) , 포스포이노시톨 -3- 키나제, Uav, Grb- 2 동이 알려 져 있다 (32). 최근 인터페론 수용체의 신호 전이 연구를 통해 JA K-STATS(j an us kina se-sig na l tran sducti on trans ducer and acti va to r of tran scri ption ) 경 로가 알려졌다 (33). JA K-STATS 경로를 이용하는 cyt ok i ne 수용체들은 세포질 쪽 부위에는 효소 기능이 없으며 cyt ok i ne 결합 시 세포질에 존 재하는 JA K 족의 티로신 키나제들과 결합하여 J AK 를 인산화시킨다.

P p )?/ 三p

J AK 는 STAT 에 속하는 전사 요인을 인산화시키고 STAT 는 핵으로 이 동하여 다른 전사 인자와 결합하여 c yt o ki ne 에 의 한 유전자 발현을 조절 한다(그림 7-9). 7 一 3 - 2 G 전백질 G - 단백질은 수용체에 인지된 신호를 effe c to r 분자로 전달하여 주는 역할을 수행하고 있댜 신호가 수용체에 인지되면서 세포 내로 신호가 전달되는 첫 단계로 이 수용체와 관련이 있는 G- 단백질이 반응을 시작 한다 G - 단백질에 신호가 전달되면 비활성형인 GDP 결합 G- 단백질이 활성형인 GTP- 결합 G- 단백질로 바뀌면서 신호를 전달한댜 G_ 단백질 에 의해 인지된 신호는 다음 단계로 세포 내에 존재하는 eff ec to r 분자로 전달되어 신호를 증폭시킨다. 활성화된 G- 단백질은 아데닐레이트 시클 라제와 PLC 또는 이온 채널들을 활성화시켜 cAMP, DAG, lP3 등을 생 산한댜 세포의 성장과 관련이 있는 G- 단백질은 ras(34, 35) 로서 티로신 키나제 수용체에 의해 활성화된다(그림 7-10). Ras 단백질의 분자량은 21 kDa 이며 원형질막의 세포질 쪽에 위치하고 있댜 ras 가 활성화되려면 SH2 와 SH3 부위로 구성되어 있는 She 나 Grb-2 등의 adapt or 단백 질 이 필요하다 (36). ras 의 활성 도가 adap tor 단 백질을 이용한 단백질-단백질 간의 상호작용에 의해 증가됨이 알려졌다. 티로신 키나제인 수용체가 리간드의 결합에 의하여 자동 인산화되면 Grb-2 단백질이 수용체에 결합하게 된다. Grb-2 의 SH3 부위에는 SOS (son of sevenless) 단백질들이 결합되어 있으며 이 SOS 가 ras 를 활성화 시킨댜 SOS 는 GDP 가 결합된 비활성 ras 로부터 GDP 를 분리하고 GTP 를 결합시킨다. ras 는 ra f와의 기능과도 관련이 있는데 티로신 키나제인 수용체의 자동 인산화에 의하여 ras 가 활성화되면 세린/트레오닌 키나제 죽 MAP 키나제(rnit o g en acti va te d ki nase) 의 활성이 증가된다.

〉S l:Vo?나 ?sahve 麟지질 제

7-3-3 포스포이노시톨 대사 활성화된 G- 단백질은 원형질막에 존재하고 있는 포스포리파제 (PLA1, PLA :;,, PLC, PLD) 들을 활성화시킨다. 이들 포스포리파제는 인지질들을 가수분해하여 신호를 전달하는 새로운 분자들을 생성한다. 이중 특정 포

스포리파제는 다 른 종류의 인지질과도 반응한다. PLC 는 PIP2 를 가수분 해 하여 막에 남게 되 는 DAG 와 수용성 인 lP3 를 만든댜 DAG 와 lP3 는 제 2 의 전령으로서 DAG 는 PKC 를 활성화시키고 lP 3 는 세포내 칼슘 저장소 로부터 C 같을 동원시켜 외부 자극에 대하여 세포 내 반응을 개시한다 (그립 7- 1 1). ras 암 유전자의 경우, 정상 ras 유전자는 G- 단백질을 암호화하고, 변 형된 ras 는 PI 대사의 기능에 악영향을 주는 단백질을 암호화하는 것으 로 알려졌댜 즉, 생쥐 세포에 변형된 ras 를 넣어 주면 성장 인자가 없어 도 포스포이노시돌의 양이 증가되었다. 이러한 결과는 변형된 ras 유전 자의 산물이 PLC 를 활성 화하고 있음을 의 미 한다(그림 7-12). 이 러 한 현 상은 성장 인자에 의해 자극을 받지 않아도 PI 대사가 작동하는 것으로 서 암세포의 제어되지 않는 성장을 설명할 수 있다. 한편 PDGF 에 의해 PI 대사가 활성화되면 fa s 와 my c 과 같은 암 유전 자가 발현되는데 이렇게 발현한 단백질은 다른 유전자의 발현을 조절할 가능성이 있고, 이러한 가능성은 세포 대사의 변화를 의미한다. 7-3-4 단백질 키나제 세린/트레오닌 키나제 세린/트레오닌 단백질 인산화 효소는 단백질의 세린 또는 트레오닌 위치에 인산기를 결합시키는 효소이며 활성을 증가시키는 요인에 따라 단백질 키나제 A(cAMP 에 의해 활성화됨)， 단백질 키나제 G(cGMP 에 의 해 활성화됨), Ca 인 /CaM- 의존성 단백질 키나제로 구분된다. PKC 는 암 촉진 인자인 포볼 에스터의 세포 내 수용체임이 밝혀졌다. 외부 신호를 받아들인 수용체가 G- 단백질을 통해 혹은 Ca2+ g a t e 를 통해 PI 에 특이 성을 가지는 PLC 를 활성화시키면 PIP2 로부터 DAG 와 lP3 를 생산한다. DAG 는 세포 내에서 단시간 내에 분해되는 데 반해 포볼에스터는 DAG

의

성장인자

와 동일한 작용을 하면서 분해되지 않아 PKC 를 통한 신호 전달 경로와 암의 발생 경로가 비슷한 과정을 거칠 수 있다는 추측을 낳게 하였다. 실제로 몇몇 p ro t oonco g ene 의 전사 후 변형에 PKC 가 관여한다는 것이 알 려졌다. PKC 의 작용은 특히 유전자의 발현에서 중요한데 inter leuk in- 2 수용체 의 유도나 c_fO S , c-m y c, c-j un 과 같은 p ro t oonco g ene 의 활성 화에 작용하고, 섬유 아세포에서 PKC 아속들의 과발현 (over expr ess i on) 을 통해 PKC 가 성장 조절에 중요한 역할을 한다는 것이 알려졌다. 최근 보고에 의하면 c-fo s 는 PKC 에 의해 인산화되며 역시 인산화된 전사 인자 API / c-j un 과 복합체를 이루어 특정 enhancer elemen t (TGACTCA) 에 붙어서

meta llo th i o n ein Ila 나 colla g enase 의 전사를 조절하고 있댜 한편 int e r l eu- ki n2 와 이 수용체의 a - 소단 위체 , 그리고 /3-인터페론 유전자의 다면 발 현 중계자(p le i o tr o pi c m edi a t or) 인 nuclear fa c t or - kB 의 경우 세포질에서 억제 단백질과 결합하고 있다가 PKC 에 의해 인산화되면서 억제 단백질 과 분리되어 핵으로 이동하여 여러 유전자의 발현을 돕는다고 밝혀졌 다. 그 밖에 도 lute in izin g hormone, gly c o p h ori n, pro lacti n, calcit on in , pla srn ino g e n acti va to r , om ithi n decarboxy la se , r -in t e r fe r o n, his t i d i n e decarboxy la se, seroto n in N-ace ty l tr ans f erase 의 유전자 발현 에 PKC 가 관 여하고 있음이 알려졌다 (37) . 한편 PKC 는 EGF 수용체를 반복적으로 인산화시켜 EGF 에 대한 친화 도를 약화시키고 수용체 자체의 티로신 키나제 활 성도 를 방해하여 결국 수용체의 기능을 약화시킨다 . 이외에도 GnRH 수용체, 무 스카린 아세틸 콜린 수용체, AVP 수용체, CRF 수용체, a1- 아 들 레날린 수용체, /3 - 아 들레날린 수용체에 의해 인지된 신호가 PKC 에 의하여 약화 될 가능성이 있는 것으로 보고된 바 있다. Raf는 위에서 언급한 바와 같 이 R as 의 기 능 약화를 위한 중계자이며 신호가 인지되면 M 사) 키나제가 순차적 으로 활성화되어 세포핵에서의 유전자 발현을 조절한다 (33) . 티로신 키나제 티로신 키나제와 포스포티로신 포스파타제는 상호 조절되어 목표 단 백질의 티로신 잔기에 인산기를 더하거나 제거시켜 신호의 전달을 정상 적으로 수행한다 . 세포의 성장에 관여하는 티로신 키나제의 인산화는 세 포가 분화 단계에 있을 때 티로신 포스파타제에 의하여 탈인산화가 되 어 야 한다 PTPlB(ph osph oty ros in e ph osph ata s e 1B) 와 같이 탈인산화 활 성이 상실되면 계속적인 인산화를 유발시켜 세포의 성장을 조절할 수 없게 된다. 많은 종양 유전자가 티로신 키나제임이 잘 알려져 있으며 PTPlB 가 탈인산화 효소의 하나라는 사실은 이러한 경로가 암 유발에

중요한 단계임을 시사해 주고 있다. 티로신 키나제는 src 키나제라고 불리고 있으며 세포질이나 원형질막 에 존재하는 수용체와 직접 결합을 하지 않더라도 의부 신호를 매개 또 는 증폭시킬 수 있댜 티로신 키나제에 의해 인산화되는 단백질로 Abl 이 보고되어 있는데 DNA 에 결합하는 능력이 있는 것으로 보아 세포질에서 전달되 는 신호 를 핵 안의 유전자에게 전달하는 단백질일 것으로 추측된 댜 src 종양 유전자 산물은 특히 단백질의 티로신 잔기의 인산화에 관 여하며 그 외에 Ab!, Jes , erbB 암 유전자들도 여기에 관여하고 있음이 알려졌댜 7-3-5 유전자의 전사 신호가 수용체에서 인지된 후 원형질막과 세포질까지 전달되는 과정 에서 앞에서 언급한 암 유전자들의 산물이 작용하고 있음이 알려져 있 으나 아직 밝혀지지 않은 물질들이 많이 있다. 이중에는 핵에 존재하는 암 유전자 산물이 있는데 이들은 주로 DNA 에 결합하는 능력이 있으며 주로 유전자의 전사를 조절할 수 있는 단백질로서 세포의 성장 분화에 관여하는 유전자의 발현을 조절한다. 전사 인자로서의 암 유전자들은 이 들 자체의 발현이나 기능이 세포 조직에 특이하게 또는 세포 주기에 따 라 조절되어 직접적으로 성장 및 분화에 관여한다. 이들은 DNA 에 결합 하는 부위와 단백질-단백질 결합 부위를 가지고 있으며 성장 인자의 자 극이 전달되면 곧바로 DNA- 단백질 또는 단백질-단백질 상호작용을 통 해 유전자 발현을 조절한다. 이 조절이 평소에는 억제되어 있다가 과발 현이나 과소 발현 (undere xp ress i on) 되면 이 억제는 풀리며 암세포로 전 환되어 직접 유전자 발현에 기여한다. 그 예로 AP-1, fos , jun 동의 암 유전자 산물은 유전자 전사를 활성화시켜 암세포를 유도한다. 이들은 DNA 에 직접 결합할 능력을 가지고 있으며 PKC 에 의해 조절된다. 핵에

존재하는 암 유전자의 산물은 직접 다른 유전자의 전이를 조절하므로 전이 인자로서의 역할을 하고 있고 이 균형에 이상이 발생되면 세포 성 장의 균형이 깨진다. Reti no blasto m a(R b ) 유전자는 암 유발에 관련 있는 유전자의 발현을 억제하고 있다가 그 억제 기능의 상실로 유전자 발현 을 촉진시킨다. 이와 같은 암 억제 유전자들은 세포 주기에 따라 인산화 정도가 변화되어 Rb 의 활성화와 세포 주기가 관련이 있음을 시사해 주 고 있다. 7-4 전사 인자 원핵 세포의 유전자는 여러 개의 소단위체로 이루어진 한 종류의 RNA 중합 효소에 의해 DNA 에서 RNA 로 전사된댜 유전자의 선택적인 발현 은 원핵 세포의 RNA 중합 효소와 6 인자족 중에서 특정 (J 인자와의 상호작용으로 촉진 유전자를 인지하여 DNA 로부터 RNA 를 합성한댜 대 장균의 경우 일반적인 배양 조건에서 전사에 관여하는 6 인자는 a70 이 댜 a 70 은 촉진 유전자에 결합하지 못하나 RNA 중합 효소 - 6 복합체 형성시 촉진 유전자에 결합하여 전사 기능을 수행한다. 한편 질소원이 결핍된 배지에서는 a54 와 복합체를 형성하여 다른 촉진 유전자 DNA 를 활성화시킨다 즉 원핵 세포에서의 전사는 한 종류의 RNA 중합 효소와 조건에 따라 선택된 6 인자와의 상호작용으로 유전자 발현이 조절된다. 한편 진핵세포 유전자의 전사는 세 종류의 DNA- 의존성 RNA 중합 효소에 의해 조절된다. 큰 리보소멀 RNAs(Large ribo somal RNAs) 의 전 사를 담당하는 RNA 중합 효소 I , mRNA 와 대부분의 작은 핵 RNAs (small nuclear RNAs) 의 전사룰 담당하는 RNA 중합 효소 Il, 작은 리보 소멀 RNA 와 tRNA 및 U6 snRNA 생성 을 담당하는 RNA 중합 효소 III 가 있으며 이들은 프로모터로부터 전사를 수행하기 위해 여러 종의 보

조 단백질을 필요로 한다. 보조 단백질로는 일반 전사 인자, enhancer 인 자 둘 전사 중개 인자, TATA - 결 합 단백질과 회합하는 인자 (TAF) 들 등 이 알려져 있다. 한편 최근 일반 전사 인자에 속하는 TATA- 결합 단백 질 ( TBP) 이 세 종류의 RNA 중합 효소( I , II, III) 에 의한 복합체에서 공 통적인 구성 요소로 존재함이 밝혀졌다. 여러 종 의 진핵세포를 사용하여 RNA 중합 효소 II 유전자의 촉진 유 전자를 관찰한 결 과 유전자의 발현 조절을 위한 두 가지 특징이 밝혀졌 댜 이 TATA box 와 전사 개시 부위를 포함하는 pro moto r pro x ima l elemen t와 enhancer 또는 up s tr e am acti va ti ng 서 열 이 라 하는 DNA 조절 인자이다 . Enhancer 는 유전자에 따라서 대체로 촉진 유전자와 멀리 떨어 져 있고 방향성과 위치에 관계없이 유전자 발현에 영향을 미친다. RNA 중합 효소 II 의 전사 작용을 조절하는 전사 인자도 두 종류로 나뉘는데 이 는 기본 전사 인자와 전사 활성제이다. 기본 전사 인자는 전사가 정확 한 부위(i n iti a ti on s it e) 에서 시작되게 하고 일반적으로 모든 유전자 발현 에 필 요하며 일반 전사 인자라고도 한다. 전사의 활성제는 전사 작용을 활 성화시키며 유전자마다 특유의 인자가 존재하나 몇몇 경우에 있어서 는 여러 개의 유전자에 동일하게 사용되기도 한다. 활성 단백질은 DNA 결합 부위와 활성 부위로 구성되어 있으며 활성 부위와 유전자 발현을 활성화한댜 최근 활성제와 일반 전사 인자 사이에 me diat o r , adap tor , 또 는 보조활성제 등이 작용하는 밝혀져 있고 염색체의 소단위체 구조까지 가세하여 전사 인자간의 복잡한 상호작용에 의하여 유전자 발현이 조절 되는 것으로 알려져 있다 . 7-4-1 일반 전사 인자 RNA 중합 효소 II 에 의한 전사의 시작은 일반 전사 인자가 순차적으 로 복합체 (tran scri ption pre in itiat i on com p lex) 를 형 성 함으로써 이 루어 진

댜 아직까지 모든 요인들의 기작이 밝혀지지 않았지만 , 9 종 이상이 존 재하는 것으로 보인다(표 7- 3) . Promoto r pro x im al elem e nt 중 TATA 부 위는 RNA 중합 효소 II 유전자에 존재하며 TATA 부 위 결 합 단백 질 과 TFIID 복합체가 결합한 후 일반 인자와 RNA 중 합 효소 II 가 순 서 적 으 로 복합체 를 형성한다(그림 7-13). 일반 전사 인자 중 TFIID 복합 체인 TBP 은 유일한 서열 특이성 DNA 결합 요소이댜 일반 전 사 인자 들 은 기초적인 전사 또는 전사 억제에 관여하며 전사 활 성화 는 전 사 활 성제 와 일반 인자의 상호작용에 의해 유도된다. 7-4-2 전사 인자 단백질 인산화 효소에 의해 인산화된 단백 질 의 과인산화된 영역은 히 스톤에 대한 결합 부위로써 작용할 가능성이 있고 특정한 유전자 를 활 성화하는 전사 인자를 조절할 수 있다. DNA 에 결합하 는 활 성제 들 의 경 우 여러 종류의 DNA 결합 형태가 존재하는데 helix - tu m- h elix , zin c fing e r, homeodorn ain, 스테로이드 호르몬, he li x- 루프 - hel i x, leu ci ne zip per 등이 알려 져 있댜 DNA 결합 단백 질의 구조는 DNA 염 기 서 열 을 어떻게 인식하는가에 따라 몇 개의 유형으로 분리되었다. helix - tu m- heli x 구조의 단백질은 구조의 유사성으로 비교적 쉽게 확 인되었지만 다 른 유형의 구조는 구조 연구를 통해 확인한 후 서열을 바교하여 밝혀지 게 되었다. Helix - tu rn-helix ( HTH) HTH 구조는 DNA 인식을 위해 존재하는 구조 중 처음으로 밝혀진 형태이며 이 이론으로부터 많은 HTH 단백질과 단백질 -DNA 복합체를 확인하였다. HTH 단백질의 구조를 상세히 분석한 결과 다른 유형의 DNA 결합 단백질들이 s ite -s pecifi c 한 방법으로 DNA 를 인식하고 있다

표 7-3 RNA 중합 효소 II 의 전사 인자들 (38) Mammalia n Functi on Drosoph il a Yeast IIA To fac ili t a t e IID int e r acti on IIA IlA wi th the pro mote r /t e m p la te . IIB Bind s to RNA poly m erase II. IIB RAP 30/1 0 Re quire d for pre - in itiat i on comp le x for mati on . IID I3in d s to the TATA- ho molog y. B IID May fun cti on like the bacte r i al sig m a fac to r to pos it ion poly m erase on the pro mote r / tem p la te . IIE Bin d s to the RNA poly m e rase. IIE RAP 30/7 0 Re quired for pre -in itiati on comp le x for mati on IIS Elong a ti on fac to r ; not req uire d for pre - in itiat i on comp le x for mati on . RAP, RNA poly m erase-b i n d i ng pro te i n 는 생각을 할 수 있게 되었다. ACro 단백질, E. coli CAP 단백질, A 억 제 물질의 DNA 결합 부위와 같은 DN A 결합 단백질의 결정 구조가 알 려졌다. 세 단백질의 DNA 인식 부위를 관찰한 결과 이 부위는 a- 헬릭 스와 turn 그리고 두번째 a- 헬릭스로 구성되어 있었다(그림 7-14). 이 러 한 구조는 lac 억 제 물질, 434 억 제 물질, 434Cro, Trp 억 제 물질, 그리고 Fis 단백질과 같은 다른 HTH 단백질에서도 동일했다. Homeodomain Homeodom ai n 은 진핵생물에 존재하는 DNA 결합 단백질의 한 구조 이다. 초파리의 발생 과정에서 처음 밝혀진 이후 진핵생물에 널리 분포

-41 -1 7

되어 있음이 확인되었다(그림 7-15). Homeodom ai n 의 아미노산을 분석한 결과 이 부위에는 HTH 구조가 포함되어 있음이 확인되었다. 그러나 HTH 와는 달리 60 개 의 잔기 로 구성 된 Homeodom ai n 은 스스로 DNA 와 결합할 수 있는 능력을 가지고 있음이 밝혀졌다. 그리고 단백질 결정 구 조로부터 확인된 homeodom ai n 은 N- 말단 부위와 3 개의 a 一헬릭스로 구 성되어 있음이 보고되었다. Zin c Fin g e r 단백 질 - DNA 상호작용에 관련된 중요 구조 중의 하나인 zin c fi n g er 의 구조가 개구리 (Xenop us) 의 전사 인자 IIIA(TFIIIA) 에서 발견되었다. 한 편 이와 동일한 구조가 pro to o ncog e ne, 일반 전사 인자 등에서도 밝혀졌 다 (42). Zin c fi n g er 의 구조는 30 개 아미노산 잔기가 반복해서 위치하고 있으며 각 구조에 는 C y s 一 Xz or 4-Cy s-X12- Hi s-X3- sHi s( 그림 7-16) 가 있 댜 이 구조 내에 위치하고 있는 2 개의 C y s 와 2 개의 Hi s 는 z in c 와 결합 을 형성하고 있다. 그러나 이 구조는 아직까지 3 차원 구조가 밝혀지지 않은 관계로 정확한 DNA 결합 형태가 알려져 있지 않은 상태이다 . 스테로이드 수용체 스테로이드 수용체는 스테로이드 호르몬, 레티노이드, 비타민 D, 타이 로이드 호르몬 등 그 외 많은 물질의 수용체이며 중요한 조절 단백질이 댜 이 수용체는 호르몬 결합 부위, DNA 결합 부위, 전사 활성 부위로 구성되어 있음이 보고되었다. 70 개 아미노산으로 구성되어 있는 DNA 결합 부위는 8 개의 시스테인이 함유되어 있다. 글루코코르티코이드(g lu­ cocort ico id ) 수용체의 DNA 결합 부위는 z in c 가 결합되어 있는데 이 부 위는 특이적으로 DNA 결합 부위를 인식하고 있다 . 스테로이드 수용체는 2 쌍씩 4 개 시스테인을 가지고 있어서 이 부위에 2 쌍의 zin c finger 가 있는 것처럼 보이지만 서열 형태는 TF ill A의 zinc

.. p51 b - pb 10 一빼 설

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fing er 와는 매우 다르다. 글루코코르티코이드와 에스트로겐 수용체의 DNA 결합 부위를 NMR 로 연구한 결과 이 부위는 모두 한 쌍의 a- 헬릭스로 된 단일 구형임이 알려졌다. 한편 이 단백질의 결정 구조를 확인한 결과 이량체로 존재하고 있음을 알게 되었으며 N- 말단 fi n g er 에는 짧은 역평 행 8 구조로 이루어져 있고, C- 말단 fing er 에는 비튤린 a- 헬릭스가 있 음이 밝혀졌다 (43, 44).

Leucin e Zi ppe r Leucin e Z ippe r(45) 와 hel i x- 루프 -hel i x(46) 형태를 가진 단백질들은 세 포의 성장과 분화에 중요한 역할을 하고 있다. 이 구조들은 이종 이량체 (he te r odi mer) 로 이루어져 있으며 이 구조는 유전자 발현 조절에 중요하 댜 Leuc ine Zip per 구조는 처음으로 몇몇 진핵생물의 전사 인자에서 동 시에 발견되었고 지금은 동물이나 식물의 전사 인자에서 넓게 분포되어 있음 을 알게 되었다. Leuci ne Zip per 단백질의 DNA 결합 부위는 60-80 개 의 아미 노산으로 구성 되 어 있으며 이 량화(dim e ri za ti on) 를 위 한 영 역 과 DNA 와 결합하는 염기성 부위 등이 두 개의 subdo main으로 구성되어 있댜 Leucin e Zip per 서 열은 30-40 개 의 아미 노산으로 구성 되 어 있으며 7 개 의 류신이 반복하여 존재하고 있다. 또 류신의 N- 말단 부위에는 소수성 (발린 혹 은 이소류신)의 아미노산이 반복해서 존재하는 경향이 있다. Leu Zip per 부위는 두 개의 par allel a- 헬릭스 구조를 가지고 있는데 이 구조 는 반복되는 소수성 부위와 7 개의 반복되는 류신을 설명할 수 있다. DNA 와 결합하는 염기성 영역은 30 개 정도의 아미노산으로 구성되어 있 으며 아르기닌과 리신이 많이 있다 . GCN4 의 염기성 영역은 DNA 와 특 이적으로 결합하며 이황화물 결합은 이량체 형성에 중요하다. 염기성 영 역의 결정 구조가 아직까지 밝혀지지 않아 상세한 것은 밝혀지지 않았 지만 이 부위는 용액 내에서는 25% 의 헬릭스를 가지고 있고 DNA 와 결 합할 때는 헬릭스 구조로 100% 변화되고 있다. 참고문헌 1) Sin gle to n , C. K, Delude, R L. and McPherson, C. E. (19ITT) Dev. Bio l. 119, 433

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제 8 장 박테리아의 신호 전이 박테리아는 갑작스런 환경 변화 또는 악조건인 환경에서 살아남기 위 해서 매우 섬세하고도 완벽한 신호 전달계를 가지고 있으므로 환경 변 화에 잘 적 응하여 살아남을 수 있다. 아울러 주위 환경 변화를 빠르고 민감하게 감지함으로써 자신이 좋아하는 환경을 만났을 때에는 그 방향 으로 이동하고 , 자신이 싫어하는 환경을 만났을 때에는 피하거나 포아를 형성함으로써 살아 남는 기능 또는 적응 능력이 잘 발달되어 있다. 따라 서 박테리아는 다양한 주위 환경의 변화 또는 의부 자극, 죽 화학 물질, 빛 , 삼투압 , 온도 , 전기장 그리고 자기장과 같은 외부 환경의 변화 속에 서 가장 살기가 좋은 환경을 찾아가는 능력 또는 환경이 좋아질 때까지 기다리는 능력을 가지고 있는 것이다. 이 능력을 위해서는 신호 전달 기 능이 잘 발달되어 있어야 하는데, 따라서 박테리아는 완벽하고도 체계화 된 이들 기작을 갖고 있다. 박테리아는 이러한 이유들 때문에 반옹 기작 을 분자 수준에서 이해하는 데 좋은 모델로 이용되고 있으며 또한 신호 전달 기작의 연구에도 널리 이용되고 있다. 그 동안 박테리아의 신호 전달 체계는 다른 생물들, 죽 진핵세포의 신 호 전달 체계와는 많은 차이점이 있는 것으로 간주되기도 하였는데 다

양한 연구가 진행됨에 따라 다른 생물계의 그것과 비교해서 공통점이 많을 뿐만 아니라 일치점도 있음이 밝혀지고 있는 만큼 박테리아의 신 호 전달 체계를 통해서 다른 생물의 그것을 이해할 수도 있을 것이다 . 본 장에서는 단백질 인산화 를 중심으로 하여 크게 3 가지 계로 나누어 생리학적, 구조적, 그리고 기계적인 측면에서 이 들 에 대해서 알아보고자 한댜 8-1 단백질 인산화와 신호 전이 기작 1978 년 Koshland 에 의해서 박테리아에도 단백질 키나제가 존재하고 있음을 발견하기 전까지는 이들 존재가 고려되지 않았다(1), 1986 년 Krebs 는 박테리아에서의 단백질 인산화 체계는 고등 생물의 그것에 비 해서는 훨씬 존재 정도가 적으며 또한 단순하다고 이야기하였다 (2). 그 러나 이 이론에 반하는 많은 연구가 보고되면서 박테리아나 다른 원핵 세포에서의 단백질 인산화가 고등 생물의 그것과 비교해 볼 때 결코 뒤 지지 않고 있음이 폭넓게 제기되고 있다. 지금까지 여러 장을 통해서 살펴본 바와 같이 진핵 세포에서는 외부 자극이 신호 전달 기작을 통하여 세포 내부로 전달되면 단백질 인산화 가 일어나고 세포 반응을 조절하는 것이 기본적인 기작의 하나이다 . 최 근 몇 년 동안 박테리아의 신호 전달 체계 역시 진핵 세포의 그것들과 같은 주요 조절 요인으로서 단백질 키나제가 고려되었다 (3, 4). 동물이나 식물의 단백질 키나제와 같은 인산화 효소들이 박테리아에서도 탄수화 물 수송, 유전자 전사, 그리고 세포 분화 둥에 관여하는 것으로 알려졌 다. 이뿐만 아니라 이들 인산화 효소들이 박테리아만이 갖고 있는 특별 한 반응, 죽 주화성, 박테리오파지 감염, 전염성, 박테리아 특유의 광합성 올 통한 C 아 고정 둥에 관여하고 있음이 밝혀졌다 (3, 4, 5, 6, 7).

인산화 를 중심으로 크게 3 가지 체계로 나누어서 박테리아의 신호 전 달 기작을 알아보기로 하겠다. 그 림 8 - 1 은 이들 3 가지 체계인 단백질 인 산화 효소와 탈인산화 효소계, 감지기와 반응계, 그리고 인산 전이 효소 (p hosp ho t rans f erase) 계를 계략적으로 보여주고 있다 (8). 그림 8-1 A 는 고전적인 단백질 인산화 효소 및 탈인산화계 (class i cal ATP - 의 존 성 단백 질 키나제 / 포스파타제)를 나타낸 것으로 이들 효소들은 진핵세포와 마찬가지로 단백질의 세린, 트레오닌 , 또는 티로신 잔기를 인산화시키거나 탈인산화시킨다 . 모든 박테리아의 단백질 키나제는 인산 기 주게 (donor) 로서 ATP 를 이용하고 있다 박테리아의 경우, 단백질 키 나제와 포스파타제가 분리된 두 개의 단백질로 존재하면서 반응을 조절 하기도 하고, 또는 하나의 단백질로 두 가지 기능인 인산화 및 탈인산화 반응 을 촉 매하기도 한댜 그림 8-1 B 는 감지기와 반응계 (sensor- ki nas e/ resp o n se reg u lato r s y s t em) 를 나타내는데 일반적으로 < 두 개의 성분계 (tw o comp on ent s y s t em) ＞ 로 잘 알려져 있댜 이 계에서는 감지기-키나 제의 Hi s 가 인산화되는데 이때도 역시 인산기 주게로서 ATP 가 사용된 댜 이 인산기가 다시 반응 조절자의 아스파르트산에 전달된다. 따라서 반옹 조절자의 인산화가 생리 반응의 활성도를 조절하게 된다. 이뿐만 아니라 몇몇 반응(예, 질소 고정이나 주화성)에서는 이들 감지기나 조절 자 이외에도 3 개 또는 그 이상의 세포질 내 단백질이 관여하고 있다. 자 세한 내용은 8-4 에서 언급하기로 한다 . 그림 8-1 C 는 PEP(ph osph o-enolpy ru vate ) 의촌성 인산 전이 효소에 의한 단백질 인산화 및 세포 조 절을 보여주고 있다. 이 계에서는 PEP 에 의해 인산기가 계속 다음 단계 로 전달된다. 즉 PTS 인산기 전달 사슬을 통해서 전달되는데 이때 5 개 의 단백질이 관여하고 있다. 이들 단백질을 통해서 당이 전달된다.

A.

8 오 고전적인 단백질 키나제와 포스파타제계 고전적인 단백질 키나제, 죽 ATP 소모에 의해 단백질의 세린, 트레오 닌 그리고 티로신 잔기의 인산화가 이루어지는 계로서 크게 3 가지로 나 누어 살펴보고자 한댜 ATP 의존성 단백질 인산화 효소의 종류 및 그 특 성, 이 체계의 대표적인 예로서 IDH( 이소시트레이트 탈수소 효소, iso - cit ra te dehy cl rog e nase) 안산화 사슬, 그리고 박테리아의 사회적인 행동 에 관여하는 신호 전달 기작의 주요 부분을 차지하는 세린/트레오닌 키 나제에 관해 !vly x ococcus xan t hus 를 통해서 살펴보기로 하겠다. 8-2-l ATP 의존성 단백질 키나제 Nucleosid e trip hospha t e 로부터 인산기를 기질 단백질의 아미노산에 전 달하는 데 관여하는 효소인 단백질 키나제는 크게 5 가지 유형으로 나눌 수 있는데, 첫째 세린이나 트레오닌의 알코올기에 인산기를 전달하는 효 소(단백질_세린/트레오닌 키나제), 둘째 티로신의 페놀기에 인산기를 전 달하는 효소(단백질 - 티로신 키나제), 셋째 히스티딘의 l 혹은 3 번 위치, 아르기닌의 g u ani do 기, 또는 리신의 NH2 기에 인산기를 전달하는 효소(단 백질-히스티딘 키나제)， 넷째 아스파르토산이나 글루타민산의 아실기에 인산기를 전달하는 효소, 끝으로 시스테인 잔기에 인산기를 전달하는 효 소가 그것이다 (9). 박테리아에서 발견되는 대부분의 단백질 키나제는 ATP 의 r 위치의 인산기를 인산기 주게로 이용하기 때문에 ATP 의존 성 인산화 반응이라 표현한다. 물론 몇몇의 경우는 ATP 를 인산기 주게 로 사용하는 것이 아니라 다른 반응 중간체나 대사 산물, 예를 들어 PEP, 아세틸 포스페이트 (ace ty l ph osph ate ) 또는 카바모일 포스페이트 (carbamoy l p hos p ha t e) 를 사용하기도 한다(1 0, 11). 단백질-히스티딘 키나제는 신호 전달계 중 <두 개의 성분 조절계>로

잘 알려져 있는 세포 반응을 조절하는 계에 관여하는 것이 대 표적 이다 . 이들 조절계는 적어도 20 개 이상의 다른 기능을 조절하는 데 관여하는 것으로 알려져 있는데, 예 를 들어 주화성, 질소 고정, fore ig n 유전자 발 현, 포자 형성 (s po rula ti on), 그리고 분비 단백질 (exo p ro t e i n) 합성 등 다양 하댜 이 계의 신호 기작은 다음과 같다 먼저 단백질 키나제(감지기)가 외부 환경 변화 또는 외부 신호를 인지하면 자동 인산화 (au t o p hos p hor y 一 la ti on) 가 일어난댜 감지 단백질 키나제의 히스티딘 잔기가 인산화되면 반응 조절자의 아스파르트산 잔기 에 위 의 포스포히 스티 딘(p hos p hoh i ­ s tidi ne) 의 인산기가 전달된다 그 후 조절 작용이 진행되면 끝으로 단백 질 포스파타제가 조절 단백질에 작용하여 탈인산화를 시키면 이 단백질 은 비활성화 상태로 돌아가 다음 신호를 기다리게 된다 . 감지기로 작용하는 단백질-히스티딘 키나제의 일반적인 구조적 특징 은 C- 말단의 6 개의 아미노산 중 하나의 아스파라진을 가지고 있다(1 2). 대부분 이 키나제는 세포막과 결합되어 있는데 2 개의 소수성 막 관통 배 열을 가지고 있댜 세포 바깥에 위치하는 N- 말단 부분은 외부 신호 를 받고 세포질에 위치하는 C- 말단은 키나제나 포스파타제의 활성도를 조 절하는 기능을 가지고 있다(1 3). 그러나 주화성에 관여하는 Che A( 키나 제)나 질소 고정에 관여하는 N tr B 는 세포질 단백질로서 신호 를 세포 내 에서 받기도 한다 (12, 14). 홍미로운 사실은 인산화된 Che A 가 인산기를 질소계인 N trC에 직접 전달하기도 하는데, 이는 박테리아의 성장 및 대 사에 서로 다른 경로가 직접 연결되어 있음을 보여주고 있다 (15). 박테리아에 존재하는 많은 단백질 키나제들이 단백질 세린/트레오닌 키나제에 속한다. 박테리아의 경우 단백질의 트레오닌보다는 세린에 더 많이 또는 더 자주 인산화가 이루어지고 있다(1 6). 단백질 키나제가 어디 에 존재하느냐에 따라 두 그룹으로 분류할 수 있는데, 하나는 세포질에 존재하며 다른 하나는 리보솜이나 막에 결합되어 있다 07, 18). 박테리아 에서 발견되는 이들 키나제들은 어디에 존재하느냐에 관계없이 인산기

주게 로 서 대부분 ATP 를 사용하는 것과 자동 인산화가 잘 일어나지 않 는 특 징이 있댜 많은 단백 질 세린 / 트레오닌 키나제가 여러 종의 박테리 아에서 발견 되었 는 데, 진핵세 포 의 키나제와 아미노산 서열에서뿐만 아니 라 조절받는 요인 들 에까 지 비 슷 한 것 으로 보고되었다 . 예 를 들 어 My x o- coc cus xan t hu s 로부 터 단백 질 세린 / 토레오닌 키나제 를 발현시키는 유전 자인 p knl 의 아미노산 서 열 이 진 핵세포 키나제의 촉 매 부위의 그것과 거의 일치 하 는 것으로 나타 났 다(1 9) . 이 유전자의 생성물인 Pknl 은 세린 과 트 레오닌 잔 기 모 두 에 자 동 인산화가 일어나며 분화 를 조절하는데 중 요 한 역 할을 하 는 것으 로 알려 졌 다 . E. col i로부터 단백질 키나제 C 와 같은 효 소가 발견 되었 는 데 ( 2 0), 이 효소는 동물의 단백질 키나제 C 와 마 찬 가 지로 Ca2’ 및 인지 질 의 존 성이며, DAG 나 포볼 에스터에 의해 활성 화되기도 한다. 이러한 발견 은 적어도 단백질 키나제의 몇몇 종류는 진 핵 세 포 의 그 것 들 과 비 슷 한 것 으로 여겨진다. 박테리아의 단백 질 트 레오닌 키나제 활성도가 E. col i에서 처음 보고 된 이래 (2 1), 여러 종의 다른 박테리아에서 발견되었다. 예 를 들어 Rho-dosp iril l u m rubrum(22), Rhodomi cr obiu m vannie l ii( 23 ), Clostr idi u m the rmosu[fu r ic u m(24), S. pyo g e nes(25), Pseudomonas aerug ino sa(26) 등 이 그것이다. 홍미 있게도 이 들 키나제는 진핵세포의 그것과는 기능 면 에서나 아미노산 서열에서도 비슷한 점이 없으며 특히 동물의 그것에 작용하는 활성제나 억제제에도 반응하지 않는 것으로 나타났다 . 그러나 아직까지 박테리아의 단백질 티로신 키나제의 분리 정제나 유전자 클로 닝에 관해서 보고된 바가 없다 . 따라서 그 효소의 구조나 기능의 이해는 좀더 기다려야 할 것이다. 박테리아의 ATP 의존성 인산화 효소는 인산기 주게로서 ATP 를 사용 하지만, 몇몇의 경우는 주게로서 다른 뉴클레오티드를 사용하기도 한다. P. aeru gz· nosa 에서 발견된 단백질 Al g R2 는 주게로서 ATP 뿐만 아니라 GTP 도 사용하고 있다('2:7). 또한 Leg ion ella m i cdade i에 존재하는 PK2 는

cAMP 뿐만 아니라 cGMP 의존성 인산화 단백질이다 (2 8 ). 또 다 른 박테 리아의 단백질 인산화 효소는 진핵세포의 키나제와는 달리 외부 단백질, 예를 들어 카세인 (case i n), 히스톤(hi s t one), 프로타민(p ro tami ne), 또는 포 스비틴(p hosv iti n) 등은 인산화시키지 못한다 (3) . 이러한 이유로 해서 이 들 단백질을 기질로 하여 박테리아의 키나제 활성도 를 측 정한 초기 연 구에서는 단백질 키나제들을 발견하지 못하였다. 그러나 최 근 에 예외적 인 사실이 발견되었는데 S. py o g enes 는 히스톤과 프로타민 을 각각 인산 화시키는 두 개의 키나제를 가지고 있음이 보고되었다 (25). 박테리아에서 발견되는 단백질 안산화 효소는 종에 따라 다양할 뿐만 아니라, 지금까지 살펴 본 바와 같이, 진핵세포의 그것과 비슷한 면도 있 으나 박테리아 자신만이 가지는 특이성도 동시에 가지고 있다. 따라서 이들 키나제의 구조와 기능 나아가서 세포 반응 조절 기작을 이해하기 위해서는 좀더 기다려야 할 것 같다. 8-2-2 이소시트레이트 탈수소효소 인산화 순환 생명체에서 대부분의 생명 현상을 조절하는 기작 중의 하나가 단백질 의 인산화이다 (29, 30). 원핵 세포에서 처음으로 밝혀진 인산화에 의해 조절되는 기작이 E col i에서 발견된 이소시트레이트 탈수소 효소 (ID H) 가 관여하는 경로이다 (30, 31). IDH 의 인산화 순환은 이소시트레이트가 글리옥실레이트(g l y ox y la te)를 생성하는 경로를 조절하는 것인데, 죽 이 경로(g l y o xy la te c y cle) 는 식물이나 미생물 계에서 발견되는 것으로서 아 세테이트나 지방산과 같은 탄소원을 축적하는 데 필수적인 경로로서 Krebs 회로가 진행되는 것이 아니라 글리옥실레이트 회로로 진행됨으로 써 75% 의 에너지를 저장할 수 있게 된다 (32, 33, 그림 8-2). IDH 는 활성화 자리에 있는 세린 113 에서 유일하게 인산화가 일어나는 데 (33, 34), 많은 다른 인산화 효소와는 달리 IDH 가 인산화될 때 비활성

Acet소 atcee- Cl

화가 된다 (33, 35). 세린 113 을 아스파르트산으로 바꾸었을 때에도 이 효 소는 비 활 성화가 되는데, 이는 이 부분의 아미노산 잔기가 음전하를 가 질 때 비 활 성화가 됨을 보여주고 있다 (34). IDH 의 활성화 자리에 존재하 는 세린 113 이 기질인 이소시트레이트와 수소결합을 하는데, IDH 가 인 산화되어 비활성화되면 이소시트레이트는 입체 장애와 정전기적 반발에 의해서(인산기와 citrat e ) 세린 113 과 결합할 수 없게 된다(그림 8--J , 36). IDH 의 인산화 및 탈인산화는 하나의 단백질이면서 두 개의 기능을 가 지 는 효소인 IDH 키 나제/포스파타제에 의 해 촉매된다 (37). 이 효소는 키 나제와 포스파타제의 활성도를 동시에 갖는 하나의 단백질로서 같은 활 성화 자리를 가지고 있다. 즉, 같은 활성화 자리에서 인산화 및 탈인산화 를 위해 두 개의 기질이 작용한다는 것이다. 이 효소는 또한 특이하게도

Arg 129

ATPase 의 활성도를 가지고 있는데, 이 효소의 활성도는 ATP 또는 ADP 의 세포질 내 농도의 영향을 받게 된다. 동시에 이 효소의 ATP 결합 자 리 역시 하나로서, 이 효소는 하나의 기질 결합 자리 및 하나의 ATP 결 합 자리를 가짐으로써 세포 반응을 조절한다 . 즉, 탈인산화 반응은 먼저 이 효소 (IDH 키나제/포스파타제), ADP 및 인산화 ID H(p hos p ho-IDH) 의 4 개 복합체를 형성한다. 그리고 인산화 -IDH 의 인산기가 ADP 에 전달되고

E广 E-Af P ◄ ► E-ATP-1

다시 물 분자에 전달된다. 이 연쇄 반응은 마침내 인산화 -IDH 의 탈인산 화 를 유도하게 된다(그림 8-4, 38, 39). 이러한 IDH 인산화 순환은 이소시트레이트가 글리옥실레이트 순환으 로 가느냐 Krebs 회로로 가느냐를 결정하는 중요한 단계가 된다. 인산화 에 의해 IDH 가 저해되면 이소시트레이트는 Krebs 회로로 진행될 것이 다 (32). 이러한 경로의 선택을 조절하는 가장 중요한 요인 중의 하나로 서 AMP 를 들 수 있다. AMP 는 IDH 포스파타제를 활성화시키지만 IDH 키나제 를 저해시킨다. 즉 세포 내에 AMP 가 많으면 세포는 에너지를 필 요로 하게 되는데, 이때 AMP 가 IDH 포스파타제를 활성화시킴으로써 이소시트레이트는 Krebs 회로로 진행되며 따라서 세포가 필요로 하는 에너지롤 생성하게 된다. 반대로 세포 내 AMP 의 농도가 낮아지면 IDH 키나제가 활성화되면서, 이소시트레이트는 글리옥실레이트 순환으로 진 행되며 에너지를 축적하게 된다 . 따라서 세포 내의 이 효소 활성도는 세 포 내 에너지 존재 (ATP/ADP, 또는 ATP/AMP 의 비)와 밀접한 관계가 있는데, 죽 현재 대사 산물을 통해서 에너지를 필요로 하느냐 또는 에너 지를 저장하느냐에 따라 결정된다고 할 수 있을 것이다 (40).

8-2-3 단백질 세린/트레오닌 키나제 그람 음성 박테 리 아인 My x ococcus xan t hus 는 특이 한 삶의 순환과 사 회적 행동성 때문에 많은 과학자들의 관심을 끌고 있다 . 영양이 충분치 못할 때 이들은 한 곳으로 모여들어 자실체(fruiti n g bod y) 를 형성한다. 이 자실체 안쪽에는 막대 모양의 영양 세포 (ve g e t a ti ve rod- sha 1.le d cell) 들이 모여 있으며 열이나 건조한 악조건에서도 생존하게 된다(그림 8-5). 이들 점균 포자 (m yx os po re) 는 영양이나 기타 조건이 좋 아지면 다시 성 장을 계속한다 (42). M xan th us 의 발달 주기는 매우 특 이한 프로그램에 의해 진행되는데, 특히 막대 모양 세포 를 형성할 때나 점균 포자를 형성 할 때 관여하는 여러 다른 유전자가 관여하며 또한 이에 의해 일시적으 로 조절된다 (43) . 이들 M xan t hus 의 발달 순환 과정과 많은 세포들이 모이는 형 태 형성 현상들은 진핵세포의 Di ct y o ste l iu m d i sco i deum 과 같 은 곰팡이의 그것과 매우 비슷하다 (41, 44). D. d i sco i deum 은 신호 전달계의 구성 물질인 수용체, G- 단백질, 조절 자, 그리고 다양한 단백질 세린/트레오닌 키나제를 가지고 있으며 이 들 이 발달이나 생활 주기에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다 (45). 최근 M xan th us 에서 진핵세포의 그것과 거의 비슷한 단백질 Ser/Thr 키나제가 발견되었다 (46). PCR(Polym erase Cha in Reacti on ) 기술을 이용 하여 얻은 결과에 의하면 M xan t hus 는 적어도 3 개의 진핵세포의 그것 과 비슷한 효소가 존재하는 것으로 밝혀졌다 (47). 그 첫번째 단백질 인 산화 유전자가 p knl 인데 DNA 서열에 의해 유추한 아미노산 수는 693 개로 나타났으며 N- 말단 쪽의 절반은 진핵세포의 단백질 세린/트레오닌 키나제의 촉매 부위의 아미노산 서열과 거의 일치함을 보여주고 있다 (48). 이외에도 이 인산화 효소는 RXXS/T 의 아미노산 서열을 인지할 수 있으며 이 서열 내의 세린이나 트레오닌울 인산화시킬 수 있다 (49).

자

즉 p knl 으로부터 생성된 단백질인 Pknl 은 3 개의 RXXS/ T 배열을 가지 고 있는데 RQ RS( 아미노산 517-520), RLRT(540-543), 그리고 RARS (689- 6 92) 가 그것이다 (47). 이는 진핵세포의 세린/트레오닌 키나제 중에 서도 CAM - 키나제 II( 칼모듈린 - 키나제 II) 와 아미노산의 서열이나 영역의 구조가 비슷한데, 칼모듈린은 Ca 2+- 결합 단백질인데 , 이 박테리아가 점 균 포자를 형 성 할 때 Ca 2+ 을 필요로 하고 있다 (50). Pknl 의 역할을 알아보고자 결손 돌연변이체인 L1Pknl 를 제조하였고

이 유전자를 가지고 있는 돌연변이 세포는 풍부한 영양 상태에서 정상 적으로 성장하였다. 그러나 자실체를 충분히 형성하지는 못하였다. 이 돌연변이 세포는 정상 세포보다 4_8 시간 일찍 응집을 시작하였고 자실 체는 훨씬 작았으며 단단하지 않았다 . 또한 포자 형성은 정상 세포보다 더 빨랐다. 따라서 포자의 형성률이 낮았는데 정상 세포의 35% 정도밖 에 형 성 치 못하였다 (47). 따라서 M. xan t hus 의 자실 체 와 포자 형 성 에 진 핵세포의 단백질 세린/트레오닌 인산화 효소와 같은 세린 / 트레오닌 키나 제(특히 p lml) 가 관여하는 것으로 여겨진다. 그러나 아직까지 박테리아 에서 신호 전달 기작에 관한 정보는 매우 부족한 상태이다. 즉, 이 형태 형성을 위한 외부 신호, 그것을 받는 수용체, 진핵세포에서와 비슷한 역 할을 하는 G 一단백질, 그리고 조절자 등 그들의 존재 확인 및 반응 경로 등에 관하여 더욱 많은 연구가 진행되어야 할 것이다. 8-3 감지 와 반응계 (sensor-kin a se/resp o nse-reg u lato r sy st e m ) 많은 박테리아의 신호 전이에 관여하는 단백질은 두 가지로 구성되어 있는데 감지기로서의 기능을 가지는 전달자와 반옹 조절자로서의 기능을 가지는 수신자가 그것이다. 그림 8-6 에서 보는 바와 같이 비공유 결합을 통해 의부 신호가 정보로서 전달되면, 인산화 반응을 통해서(전달자 부분 의 인산화) 수신자와 정보 교환을 하며 그 정보가 세포 반응과 연결되는 데 이는 <두 개의 성분 신호계(tw o-com po nen t sig naling s y s t em) ＞로 널 리 알려져 있다. 감지기는 전형적으로 C- 말단(세포 내부)에 전달 영역과 N- 말단(세포 외부)에 수신 영역(i n pu t dom 책 1) 을 가지고 있다. 반응 조절 자는 N- 말단의 수신자 분자와 c- 말단의 출력 영역 (ou tp u t dom ai n) 으 로 구성되어 있다. 감지기의 입력 영역과 통신을 함으로써 감지기에 입 력된 신호가 이들 영역을 거쳐 증폭되어 출력 영역을 통하여 세포 반응

감각 - 반응조절 -~

울 조절 하게 된댜 전달자와 수신자의 정보 교환을 위한 유일한 기작에 는 인산화 및 탈인산화 반응이 관여하고 있다. 먼저 이 인산화 및 탈인 산화 반응에 대해서 살펴보고 박테리아에서 이 신호 전달계에 속하는 대표적인 세 가지 반응, 질소 고정, 주화성, 그리고 삼투 조절의 신호 전 달 기작에 대해 알아보기로 한다. 전달자가 수신자의 인산화 상태를 조절하는 기작은 그림 8-7 에서 보 는 바와 같이 진행된댜 첫째는 인산화 반응으로, 전달자 자신은 자동 키 나제 (au t o ki nase) 활성도를 가지는데, ATP 로부터 인산기를 받아 자신의 His 잔기에 인산화가 일어난다 (51). 이 인산화 Hi s 는 인산기를 수신자의 As p에 전달하는데 있어서 고에너지 중간체로 작용한다 (52). 두번째는 탈 인산화 반응으로, 전달자(몇몇 경우, 또는 많은 경우)는 포스파타제 활성 도 를 가지는데 (53), 이 분자는 수신자의 인산화된 Asp 잔기를 탈인산화 시킨다. 지금까지 알려진 전달자로 작용하는 단백질은 약 50 개 이상이 밝혀졌 다. 이 단백질의 아미노산은 약 240 개로 되어 있으며 전형적으로 N- 말 단 부분에 히 스티 딘 인산화 자리 를 가지 고 있다(그림 8-7). 그림 8 구에서 C- 말단 쪽의 네 부분 (N , Gl , F , G2) 은 촉매 자리를 나타내는데, 두 개의 G(Gl 과 G2) 는 글리신이 풍부한 영역으로서 뉴클레 오티드 결합 자리이다 (54). 수신자는 약 120 개의 아미노산으로 구성되어 있으며 N- 말단 가까이에 아스파르트산(두 개)을 가지고 있다(5.5). 또한 c- 말단 가까이에 리신을 가지고 있고, 중간 부위의 인산화 자리에 아스

전달물전 (T): |' .I. -2 40AIA -I-I- I- i

파르트산을 가지고 있다(그림 8 구). 수신자는 전달자에 비해서 비교적 구조가 잘 밝혀져 있는데, 이들 3 차 구조를 살펴보면 /3- sheet 와 a- 헬 릭스의 5 개 세트가 통과 같은 구조를 형성하고 있다 . /3 -shee t는 안쪽에 서 소수성 내부의 핵심을 형성하고 a- 헬릭스 구조에 의해서 바깥쪽이 둘러싸여 있다 (56). 이들 두 분자(전달자와 수신자)를 통해서 진행되는 신호 전달 기작은 앞에서 언급한 3 가지 예를 통해서 살펴보기로 하겠다. 8-3-1 질소 이용을 위한 조절 기능 (N it rore g ula ti on) 박테리아의 질소 대사에 관여하는 가장 중요한 효소는 글루타민 합성

효소(g lu t a mi ne s yn t he t ase) 로서 질소는 글루타민산염 과 암모니 아로부터 글루 타민이 합성되는 경로 를 통해서 생성된다. 세포가 질소를 필요로 할 때, 글 루타민 합성 효소 를 만드는 유전자인 gin A 가 발현되면서 이루어 진다. 질 소 조 절 을 위한 반응 조절자는 NRI 으로서 전사 활성화 단백질 이다. 즉 NRI 이 인산화되면 gin A 촉진 유전자에 결합함으로써 전사 (gin A ) 가 이 루 어진다 NRI 의 인산화는 히스티딘 키나제인 NRII 에 의해 조절 된댜 이 NRII 의 활 성도는 세포 내 탄소와 질소 대사 사이의 균형에 의해 조절 되 는 데 이 조절 기작에 대해서 살펴보기로 한다. 세포 내 탄소 및 질 소 대사의 비율이 두 개의 기능을 가지는 효소 (bif un cti on al enz y m e) 인 UTase/U R(uridy ly It r an sfe r ase/ uridy ly !r em ov ing e n z y me) 의 활 성도 를 조 절 한다. 이 효소는 다시 조절 단백질인 PII 의 티 로 신 잔기에 우리딜기 를 붙이거나(uri d y la ti on) 우리딜기를 제거 (de uri d y­ la ti on) 시킴으로써 히스티딘 키나제인 NRII 의 활성도를 조절한다. 만약 세포가 질 소가 필요하게 되면 UR 의 활성도가 증가함으로써 PII-UMP 에 서 우리 딜 화 반응이 일어나면서 PII 가 되며 NRII 의 활성도를 증가시키게 된다(그림 8-8). 이때 PII 가 세포 내 질소의 필요성을 감지하는 감지기 로 작용하고 있다. N 血가 활성화되면 자신의 히스티딘 잔기에 자동 인산화가 되며 이 인산기가 반응 조절자인 NRI 의 As p를 인산화시킴으로써 전달된다. NRII 는 또한 자신이 포스파타제 활성도를 가지고 있다. NRI 의 인산화는 글루타민 합성 효소의 유전자인 gin A, NRII 의 유전자인 gln L, 그리고 NRI 의 유전자인 gln G 를 전사시킴으로써 질소 대사룰 조절하는 단백질 들을 생성함으로써 세포 내 질소의 양을 증가시키게 된다 (3, 57). 8-3-2 박테리아의 주화성 (Chemota x is ) E. coli 나 Salmonella typhi, mu ri um 은 다양한 물리 화학적 자극에 반

N RI TUPANnTR \NR1 I_zuI g〈 N RADnP N RI PN

응하여 그들의 진행(수영) 방향을 조절한다. 이들은 회전할 수 있는 helic a l 편모(fl a g ellar) 필라멘트(마치 배에 있는 프로펠라와 같은 기능을 가진)에 의해서 수영을 하는데, 이 편모의 회전이 반시계 방향 (coun t er clock wise , CCW) 일 때는 계속 앞으로 진행하는 데 반해 , 회전이 시계 방 향 (cloc kwi se, CW) 일 때는 세포의 진행 방향을 돌리거나 텀불(tum ble) 하 게 된다 (58). E. col i는 자신이 좋아하는 여 러 가지 당이나, 아미노산과 같은 환경을 만나면 편모가 반시계 방향으로 회전하여 계속 진행하지만 자신이 싫어하는 지방산, 알코올, 또는 다른 독성 물질을 만나면 이 편

모가 시계 방향으로 회전하면서 멈추어 다른 방향으로 가게 된다. 지금부터 이 주화성에 관여하는 신호 전달 기작에 대해 알아보기로 한다 주화성의 신호 전달계에 관여하는 단백질이나 다른 구성 성분들은 위에서 언급한 감지기와 수신자 이외에 더 많은 세포질 내의 단백질을 필요로 한댜 먼저 많은 박테리아에서 발견된 다양한 외부 자극을 수용 할 수 있는 수용체(막 수용체 단백질)에는 4 개의 다른 단백질이 관여하고 있음이 확인되었는데 세린과 반응하 는 Tsr, 아스파르트산이나 말토오스 와 반응하는 Tar, 리 보오스나 갈락토오스와 반응하는 Trg, 그리 고 디 펩 티 드( dipepti de) 와 반응하는 Ta p가 있다 . 이 막 단백질들은 약 550 개의 아미 노산으로 구성되어 있으며 세포 바깥쪽에 감지기 또는 입력 영역을, 세포 안쪽에 출력 또는 신호 영역을 가지고 있다 (59) . 이 수용체 또는 변환 단백질은 Che R 에 의해 메틸화됨으로써 활성화 되며 che B 에 의해 탈메틸화됨으로써 비활성화된다. 이들 두 단백질은 세 포질 단백질로서 Che R 은 메틸 전이 효소 (me thy l tr ans f erase), Che B 는 메틸에스터라제 (me thy les t erase) 의 활성도를 각각 가지고 있다 (60). 그림 8 - 9 에서 보는 바와 같이 세포질 단백질은 5 개로 되어 있는데 이 들 중 Che B 를 제외한 Che A, Che W, Che Y, 그리고 Che Z 가 신호를 전달하는 데 관여하며 이들을 통해 신호가 전달되어 편모가 회전하기까 지는 약 0.1 초가 소요된다. 앞에서 언급한 Che B 는 전달자로서의 역할 보다는 전달자의 활성화를 조절하는 조절자로서의 역할을 수행하고 있 다. 먼저 Che R 에 의해 메틸화됨으로써 외부 신호가 전달자의 활성화를 거쳐 Che W 에 전달되며, 다시 Che A 에 전달되는데 이들 두 단백질은 막에 있는 전달자와 결합하고 있다 (61). Che A 는 자동 인산화를 수행할 수 있는 단백질 인산화 효소로서의 기능을 가지고 있는데, M g 양 과 ATP 가 존재할 때 , ATP 의 인산기가 Che A 의 His 48 에 전달되어 인산화 효 소의 중간체 를 형 성 하게 된다 (62). 인산화된 Che A 는 인산기를 다시 Che B 나 Che Y에 전달할 수 있다.

유인과 퇴치

이 Che B 와 Che Y 의 인산화는 불안정 하며 쉽 게 가수분해 되 어 인산화 단백질에서 인산화되지 않은 상태로 쉽게 돌아간다 (hal f - lif e time : 10 s). 편모는 생체막에 존재하는 스위치 단백질과 결합되어 있는데, 인산화 된 Che Y 가 이 단백질과 작용함으로써 신호가 전달되어 편모 운동은 CW 방향으로 회 전하게 된댜 그 후 Che Z 가 Che Y 를 탈인산화시 킨다 (Che Z 는 Che B 는 탈인산화시 키 지 못함)． 따라서 Che Z 는 포스파타제 활 성화 를 가지고 있다. Che B 의 인산화는 전달자의 탈메틸화를 유도하여 정상 상태로 돌아가 는 데 관여하고 있다. 이외에 Che W 는 Che Y 의 인 산화에 필요한 단백질인데 아마도 Che A 의 자동 인산화 반응에도 관여 하 는 것으로 여겨진다 (4, 12). 8-3-3 삼두 조절 E. col i와 같은 박테리아는 두 개의 세포막을 가지고 있는데, 세포질의 구성은 peripla sm ic 영역에 의해 둘러싸여 있다. 안쪽 막, 죽 세포질 쪽의 막은 수많은 여러 투과 효소(pe rmease) 들에 의해 이온이나 다른 분자들 이 능동 수송 기작을 통해 세포 내로 들어올 수 있다. 반면, 외막에는 po re 를 형성하는 단백질이 많이 존재하면서 작은 분자들이 수동 확산 (pa ssiv e diffu s i on) 에 의해서 peripla sm ic s p ace 로 들어온다. E. col i는 삼 투압 조절에 밀접한 관계가 있는 두 개의 주요한 porin 단백질이 있는데, Omp F 와 Omp C 가 그것이댜 Omp F 의 po re 가 Omp C 의 그것에 비해 약간 더 큰 것으로 알려져 있다. 박테리아는 배양액이나 외부 환경의 삼 투압에 반응하는데 이는 이 두 단백질인 Omp F 와 Omp C 의 비가 변함 에 따라 외부 삼투압 변화에 적응하여 생존하고 있다. 박테리아가 삼투 압 변화에 적응하며 반응하는 데 관여하는 신호 전달 기작에 관해 살펴 보기로 한다 배양액의 삼투압이 낮은 경우에는 Omp F 가 많이 존재하며 삼투압이

삼투압

높은 경우에는 Omp C 가 많이 존재한다 . 이는 삼투압의 변화가 이들 porin 단백질을 생성하는 유전자인 porin 유전자의 발현을 조절하기 때 문이다. 예를 들어 삼투압이 높은 경우, 이 신호가 신호 전달 기작을 거 쳐 omp C 유전자의 발현을 증가시 키 고 omp F 유전자 발현을 억 제하고 있다. 그림 8-10 은 삼투압 변화가 omp F 와 omp C 유전자 발현에 관여 하는 신호 전달계를 보여주고 있다. 여기에 관여하는 두 개의 단백질이 있는데 Env Z 는 내막의 감지기로서, Omp R 은 세포질 내의 반응 조절자 로 작용하고 있다. Env Z 는 본 절의 질소 조절이나 주화성에서 살펴본 바와 같이 두 개의 주요 부위를 가지고 있는데 C- 말단 부분의 운송자로 서 작용하는 부위와 N- 말단의 감지기로 작용하는 부위가 그것이다. 배 양액 또는 외부 삼투압의 변화가 감지기 부분에 의해 감지되어 운송자

부분으로 전달되는데 그 기작은 아직까지 알려져 있지 않고 있다 (63). Env Z 단백질은 두 가지 효소 기능을 가지고 있는데, 단백질 키나제 의 활 성도와 포스파타제의 활성도이다. 죽, 높은 삼투압은 Env Z 의 자동 인산화 를 증가 시키고 , 따라서 반응 조절자인 Omp R 을 인산화시킨다. 반 면 낮은 삼투압일 때 는 이 Env Z 가 Omp R 의 탈인산화를 증진시키고 있다 (57). Omp R 은 N - 말단에 수용체 영역과 C - 말단 에 DNA - 결합 영역 을 가지 고 있댜 또한 porin 유전자는 omp F 와 omp C 촉진 유전자의 up s tr e a m 부위에 Omp R 의 결합 자리를 가지고 있다 . 이 결합 자리는 omp 촉진 유전자의 -3 5 consensus 부위 에 있는 것으로 알려 졌는데 (64), 이 는 Omp R 이 RNA 중합 효소가 촉진 유전자에 결합할 수 있도록 도와 줌으로써 전사를 조절하고 있 는 것으로 여겨진다. 탈인산화 형태의 Omp R 이나 인산화 형태(인산화 -Om p R) 모두 이 부위(또는 결합 자리)에 결 합할 수 있으나 인산화 Omp R 이 훨 씬 높은 찬화력을 가지고 있다 (65). 결론적으로 이야기하면 배양액의 삼투압이 높을 때 Env Z 의 자동 인산 화가 유도되 고 다시 Omp R 을 인산화시 키 며 이 인산화된 Omp R 이 porin 유전자의 촉 진 유전자의 u p s tr eam 에 결합함으로써 omp C 유전자 의 전사를 증가시킴과 동시에 omp F 유전자의 전사를 저해하고 따라서 세포막에 존재하는 Omp C 를 증가시키고 Omp F 는 감소시킴으로써 삼 투압 변화에 적응하게 된다. 8-4 인산 전이 효소계 이 계에서 가장 잘 알려져 있는 것으로 당 전달계를 들 수 있는데, 그 림 8-11 에서 보는 바와 같이 p hosp hoenol pyru va t e(PEP) 로부터의 인산기 가 PTS(ph osph otr an sfe r ase sys t e m ) 사슬을 거쳐 전달됨으로써 당의 전 이(tr ansloca ti on), 죽 당이 세포막을 가로질러 세포 내로 들어오게 된다 .

이트:; : 트 이:겁:

PTS 에서 인산기 전달 사슬은 일반적으로 다섯 개의 단백질에 의해서 이루어지는데, Enzy m e I 과 HPr 은 당에 대한 특이성은 존재하지 않으며 단지 에너지 전달에 관여하는 단백질이다. 이에 반해 Enz yme IIA, B, 그 리고 C 는 당에 대한 특이성을 가지고 있다. PTS 의 에너지와 관련 있는 이 단백질 들 은 Hi s 잔기의 인산화에 의해 이루어지고 있다. Hi s 의 이미 다 졸 링(imi dazole ri n g)의 인산화는 N-1 이나 N-3 위치에서 일어나는데, 이는 고에너지 포스포아미데이트(p hos p ho arni da t e) 결합을 형성함으로써 당 전달에 소모되는 에너지원으로 이용되고 있다. 본인은 본 절에서 장 내 세균의 박테리아에 있어서 PTS 와 PTS 에 의한 주화성 조절에 관여 하는 신호 전달 기작을 살펴보기로 하겠다. 8-4-1 장내 세균의 인산 전이 효소계 (PTS) 박테리아에서 탄수화물은 다양한 기작에 의해 전달되는데 그 중 하나 가 당 인산 전이 효소계 (PTS) 이다. 이 PTS 는 또한 PTS 에 관련이 없는 효소인 아데닐레이트 시클라제, 글리세롤 키나제 그리고 탄수화물 투과 효소 등의 활성도도 조절하는 것으로 알려져 있다 (5, 10). E. col i에서 당 특이성 PTS 단백질은 En zyme IIA g 1c( 글루코스 특이성)인데, PEP 의존성 기작에 의해 히스티딘 잔기에 인산화가 일어난다 (66). En zyme IIA g lc 의 탈인산화 형태가 세포질 내의 이화 효소 (ca t abo li c e nzym e) 나 막 통과 단백질인 투과 효소의 세포질 쪽에 결합하여 그들의 활성도를 저해한다. 반면 이 효소 (IIA g 1c) 의 히스티딘 잔기에 인산화가 일어날 때 아데닐레이 트 시클라제에 결합함으로써 활성화시킨다(그림 8-11, 5). 최근에 이 효 소 IIA g 1c 의 3 차 구조가 X- 선 결정학 및 NNIR 연구 결과에 의해 밝혀졌 는데 (67), 이 효소를 중심으로 PTS 계의 구조적인 측면, 그리고 생리 반 응 기작에 대해서 알아보고자 한다. 이 효소의 조절 기작은 PEP 로부터 인산기가 En zyme I, HPr 에 연쇄적으로 전달(이들 En zyme I 이나 HPr 은

PTS 단백질임)되어, 이 효소 (IIA g!c)의 인산화가 이루어짐으로써 세포질 이나 막에 존재하는 단백질의 활성도를 조절하고 있다(그림 8-11). 인산화된 HPr 로부터 인산기가 IIA g!c의 활성화 자리에 있는 His 잔기 에 전달되어 인산화 효소가 아데닐레이트 시클라제 를 활성화시키는데, Gly4 7 또한 활성화에 필수 아미노산이댜 돌연변이 연구에 의하면 Gly4 7 을 Ser 로 바꾸었을 때 IIA g 1c 의 구조가 변화하는 것으로 나타났다. 이는 Gl y 47 이 이 효소의 구조 유지와 밀접한 관계가 있는 아미노산으로 추정 된다. 젖당, 과당, 멜리비오스 (mel i b i ose) 그리고 글리세롤을 만드는 데 조절 자로 작용하는 유전자는 각각 lac, ma!, me!, 그리고 g[p인데 이들 유전 자의 전사는 CRP(cAMP 수용체 단백 질)과 cAMP, 그리 고 유도 물질 (i nducer) 로 작용하는 탄수화물 특이성 억제 단백질에 의해서 조절되고 있댜 따라서 당의 생성은 세포질에 있는 이 유도 물질과 cAMP 양과 밀 접한 관계가 있댜 또한 PTS 를 거쳐 생성되는 당이 PTS 를 거치지 않고 생성되는 당 (non-PTS 당)으로 전달되는데, 즉 non-PTS 당의 생성을 위 해 PTS- 당이 이용되고 있다. 따라서 IIA g 1c 에 의해 조절되는 기작은 세 포질에 유도 물질의 생성과 cAMP 합성에 밀접한 관계가 있다 . 죽 세포 바깥에 있는 당이 세포 내로 들어오면 세포 내의 non-PTS 당의 생성 이 필요치 않기 때문에 이 효소 IIA g 1c 에 의해 세포질 내의 유도 물질과 cAMP 의 생성이 억제된다. 그 기작을 살펴보면 다음과 같다. 세포 바깥 의 당이 세포 내에 들어오게 되면 HPr 의 인산화 Hi s 가 탈인산화되는데 이때 인산기가 당에 전달된다(그림 8-11). HPr 의 인산화 양이 적을 때에 는 IIA g lc 의 인산화가 줄어든다. 죽 세포 내 IIA g lc/ 인산화 IIA g1 c 의 비율은 HPr/ 인산화 HPr 의 비율과 일치한다. 따라서 IIA g 1c 이 인산화되지 못하면 세포 내 아데닐레이트 시클라제의 활성화가 되지 않는다. 결국 IIA g lc 의 탈인산화는 non-PTS 탄수화물 투과 효소나 글리세롤 키나제의 저해 원 인이 되는 것이다. 세포질 내의 cAMP 와 유도 물질의 감소는 non-PTS

re g ulon 에 의 한 유전자의 전사 속도를 감소시 킨다. 따라서 PTS 와 non - fYf S 는 서로 상반된 기작에 의해 연결되어 있다. 죽 PTS 의 활성화 는 non - fYf S 의 비활성화를 촉진하고 PTS 의 비활성화는 non-PTS 의 활 성화 를 유도한다. 8-4-2 주화성의 조절을 위한 인산 전이 효소계 PTS 에 의해 조절되는 주화성의 신호 전달 기작은 앞 절 감지기와 반 응계에서 살펴본 주화성의 그것과는 명확하게 구별된다. 앞에서 살펴본 주화성을 PTS 에 의해 조절되는 주화성과 구별하기 위해 MCP( 메틸 수 용 주화성 단백 질, meth y l- accept ing chemota x is p ro t e i n) 에 의 한 주화성 으로 명명하기로 하겠다. PTS 에 의한 주화성은 그람 양성 세균 (68, 69, 70) 뿐만 아니라 gr am- po s iti ve 박테리아 (71) 에서도 발견되었다. PTS 에 의한 주화성에는 2 개의 일반적인 단백질인 효소 I(EI) 과 HPr, 탄수화물­ 특이성 효소인 효소 IIABC 복합체(IJA, IIB, ITC) 들, PEP 그리고 기질로 서 탄수화물이 포함되 어 있다(그림 8-12). PEP 로부터 인산기 가 EI 의 히스티 딘 잔기 에 전달되며, 이 인산화된 EI 에 의해 다시 HPr 의 히스티딘으로 전달된다. 이 인산화된 HPr 의 인산기 가 막 통과 단백질인 IIABC 복합체에 다시 전달된다. 복합체 단백질은 20 개 이상의 서로 다른 유전자로부터 아미노산 서열이 밝혀졌는데 홍미 있게도 어떤 경우에는 IIABC 가 하나의 폴리펩티드로 구성되어 있었다 (예, 만니톨에 관여하는 IIABC). 몇몇의 경우에는 두 개의 폴리펩티드(예, 포도당에 관여하는 IIA 와 IIBC) 그리고 몇몇의 경우에는 3 개의 각각 다 른 폴리펩티드로 구성되어 있는데 cellob i ose 의 수송 및 주화성에 관여하 는 IIA, IIB, 그리 고 IIC 가 그것 이 다 (66, 72). 효소 IIA 의 인산화는 인산화 HPr 에 의해 히스티딘 잔기에 일어난다. 이어서 이 인산화는 IIB 의 시스 테인이나 히스티딘에 전달되는데 단백질에 따라 시스테인 또는 히스티딘

out in

이 결정된다. 유일한 소수성 영역을 가지고 있는 IIC 는 기질의 결합과 수 송에 관여하는 것으로 여겨지는데, 이 IIC 가 11B 로부터 인산기 를 받아서 당(기질)에 전달하는 것으로 알려져 있다. 홍미롭게도 MCP 에 의한 주화 성과 Prs 에 의한 주화성은 정확하게 구분되며(결코 상호 의존적이지 않 음)， 이 두 계에 의한 주화성의 반응 강도도 다른데, MCP 에 의한 주화성 이 Frs 의 그것보다 적어도 다섯 배 이상 강한 것으로 나타났다 (73). 四 S 에서 어느 단백질이 주화성과 당 수송에 관여하는가를 알아보았 다. 먼저 EI 을 생성하는 유전자인 pts 1 의 인산화가 부족한 유전자를 발 현시켰을 때 Frs 단백질의 인산화와 주화성 반응이 일어나지 않았으나 약간의 당 수송은 일어났다. 이는 화학 물질의 수용 (chemorece pti on) 과 인산화 그리고 수송은 상호 밀접한 관계가 있음을 의미한다. 이번에는 주화성 의 반응을 하지 않는 박테 리 아인 Klebsie ll a p necemon i ae 로부터

PTS 의 단백질인 II 를 발현시키는 유전자를 E. col i에 전이시킨 후 인산 화 및 주화성 반응을 검토해 보았을 때 인산화 및 주화성 반응이 관찰 되었다 (74) . 이 결과는 IIABC 복합체가 신호 전달 기작에 간접적으로 참 여하고 있음을 의미한다. 즉 신호 전달 기작의 중요한 중재자가 아닌 당 수용체로서의 역할만 담당하는 것으로 여겨진다 . 그렇다면 어떻게 PTS 에 의해 주화성이 일어나는가? 여기에 대한 실 험 결과는 명 확하지 않으나, PCP( 포스포릴-주화성-단백질)가 PTS 와 MCP 계 를 연결하는 단백질 또는 연결자로서 작용한다는 것이 모델로 제 시되고 있다 (75). 이 모델에 의하면 PTS 의 IIABC 에서 HPr, 그리고 EI 에 전달되 고 다시 EI 에 전달된 신호가 앞에 서 언급한 PCP 에 전달된다. 이 PCP 는 MCP 의 Che A 나 Che Y 와 작용하여 편모 운동이 일어난다는 가 정이댜 이 가정의 가능성에 대해서는 생화학적안 방법과 유전자 이용을 통한 방법을 동원하여 좀더 연구되어야 할 것으로 사료된다. 최근 Fox (76) 등은 EI 의 인산기가 세포질 단백질인 아세틸포스페이트와 아세틸 키나제 를 거쳐 MCP 계의 Che Y 에 전달된다는 연구 결과를 제시하였다. 이는 앞으로 언급한 PTS 에 의한 주화성 반응은 PTS 의 마지막 효소인 EI 가 MCP 계의 신호 전달 경로와 간접적으로 연결되어 있음을 시사해 주고 있다. 지금까지 본 장을 통해서 박테리아에서 일어나는 기작을 크게 3 가지 로 나누어 살펴보았다 ATP 의촌성 단백질 인산화, IDH 인산화 순환, 그리고 단백질 Ser/ Th r 키나제를 포함하는 고전적인 단백질 키나제/포 스파타제계는 진핵세포에서 발견되는 신호 기작과 거의 비슷한 반면, 질 소 조절, 주화성 그리고 삼투압 조절을 포함하는 감지기국기나제/반응 조 절자계는 이들 현상들이 박테리아만이 가지는 독특한 생명 현상이므로 이에 포함되는 신호 전달 기작은 진핵세포의 그것과는 다른 기작에 의 해서 이루어지고 있다. 그러나 최근 진핵세포에서도 메틸화 반응에 의한 생명 현상이 발견되고 있는 만큼 단정할 수는 없을 것 같다. 또한 최근

에 Koshland(78) 는 진핵 세포에서의 두 개의 구성 성분계에 대해 언급한 바가 있댜 연구 결과(원핵 세포와 진핵세포)의 상호 보완 겁정을 통해 생명 현상의 이해에 접근해야 할 것으로 생각된다 . 그러나 아직까지도 몇 가지 측면에서 박테리아에서 일어나는 신호 전 달 기작이 명확하게 밝혀져 있지 않은 상황이다. 예 를 들 어 주화성에서 Che Y 단백질과 편모의 운동을 유도하는 운동 단백질과의 작용 기작, MCP 계와 PTS 간의 연결 기작, 그리고 지금까지 살펴본 각 신호 진달 기작에 관여하는 단백질들의 정확한 활동 기작 등은 아 직도 연구되어야 할 과제로 남아 있다. 참고문헌 1 ) Wang, J. Y. J. and Koshland, D. E. Jr. (19 78) J Bi ol. Chem. 253, 7605 2) Krebs, E. G. (1986) In Boye r , P. D. and Krebs, E. G. eds. The En zym es. Vol. XVII. San Die g o , Academi c Press. 3) Cozzone, A J. (19 88) Ann Rev. Mi cr obia l. 42, 97 4) Sto c k, J. B., Sto c k, A M. and Mott on en, J. M. (19 90) Natu r e 344, 395 5) Sa ier , M. H. Jr. (19 89) Mi cr obia l. Rev. 53, 109 6) Burbulys , D., Trach, K A. and Hoch, J. A. (1991 ) Cell 64, 545 7) Grois m an, E. A and Sa ier , M. H. Jr. (1990) Trends Bio c hem Sci. 15, 30 8) Sa ier , M. H. Jr. (1993) J Cell Bio c hem 51, 1 9) Hunte r, T. (19 91) Meth o ds En zym ol. 200, 3 10) Sa ier , M. H. Jr, Wu, L. F. and Reiz er, J. (19 90) TIES 15, 391 11) Lukat, G. S., Mclear y, W. R., Sto ck , A. M. and Sto c k, J. B. (1992) Proc Na tl. A 따 Sci . USA . 89, 718

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제 9 장 식물의 신호 전이 최근의 연구 결과들에 의하면 식물계에서도 동물의 신호 전이 과정과 유사한 반응들이 일어나고 있음이 확인되고 있으나, 아직 확실한 반응 경로는 어느 신호의 경우에서도 완전히 이해되지는 못한 상황이다. 식물 계에서 지금까지 연구된 신호로서는 빛, 호르몬, 병원균, 중력 등을 들 수 있댜 빛의 경우 자외선 , 청색광, 적색광을 신호로 이용하여 식물의 성장, 발달, 발아, 개화 및 결실 등의 생명 현상을 조절하고 있으며, 식물 호 르 몬의 경우 지베렐린(gi bbere llin)과 옥신 (au xi n) 의 신호 전이 과정에 관한 연구 결과들이 보고되고 있으며, 엘리시토 (e licit or) 신호 전이 과정 을 이해하려는 연구 그리고 중력에 의한 뿌리의 굴중성(g ra vitr o pi sm) 에 관한 신호 전이 연구 둥이 진행되고 있다 . 현재 식물계에서의 신호 전이 연구는 신호와 현상 발현이 어떤 것이 든 간에 동물 신호 전이의 기본 반응들이 식물에서도 일어나고 있는지 확인하고 있는 단계이다. 그 연구 내용들을 요약하면 ® 식물 세포에서 도 G- 단백질이 존재하며 그 역할이 무엇인지에 관한 연구, ® 이노시톨 인지질 대사 과정에 관한 연구 , ® 세포질 내 Ca2+ 농도 변화와 그 역할 이 무엇인지에 관한 연구, @ 단백질 인산화 반응과 단백질 키나제들에

관한 연구, ® 신호에 의해 그 발현이 조절되는 유전자 들 에 관한 연구 등이 진행되고 있댜 본 장에서는 현재까지 식물계에서 진행되고 있는 광신호 전이에 관한 연구들을 요약해서 기술하고자 한다. 9-1 신호와 수용체 식물계에서는 수용체의 종류, 정체를 비롯하여 수용 메커니즘 등이 거 의 이해되고 있지 못한 상태이다. 몇 가지 성장 조절제들과 당들이 어떤 수용체를 가질 것이라는 보고가 있고, 질산(nitr a t e) 은 니트레이트 리닥타 제(nitrate reduc ta se) 에 의해 인지될 수 있다는 설이 있을 뿐이고, 광 수 용체 중에서 적색광 수용체인 피토크롬(p h yt ochrome) 만이 그 정체가 밝 혀져 있을 뿐이댜 청색광 신호도 식물계에서 매우 중요한 역할을 하고 있음이 분명하나 아직도 그 수용체가 밝혀져 있지 않은 상태이다 . 피토 크롬의 경우 그 구조를 비롯해서 일차 광반응에 관한 연구 결과들이 비 교적 많이 보고된 반면 생리적으로 활성형인 피토크롬 P f r 형으로부터 시 작되는 신호 전이 과정에 관한 연구는 이제 시작 단계에 있다. 식물의 외부 신호를 수용하는 수용체 분자에 관한 충분한 연구 결과는 매우 부 족한 상태임에 틀림없으나, 신호가 제 2 의 전령(예, Ca2• , abscis i c acid , au xin, gibb erell in 둥)을 통하여 전달될 것이라는 내용들이 많이 보고되 고 있댜 동물계의 신호 전이에서 중요한 제 2 의 전령으로서는 cAMP 와 Ca 안을 열거할 수 있는데, 식물계에서는 cAMP 의 존재 및 역할이 거의 알려져 있지 않은 상황이며, Ca 안이 가장 중요한 제 2 의 전령으로서 널 리 알려져 있는 상황이다. 신호 전이 과정에서 중요한 역할을 담당하는 Ca2• 은 세포질 내 자유 Ca 양이며, 이 자유 Ca2+ 의 농도 조절은 세포 의부 로부터 Ca2• 채널을 통해서 유입되거나 유출되어 조절되거나, 세포 내

Ca2+ 저장고(소포체 또는 액포)로부터 동원되어 조절되는 것으로 알려져 있댜 세포 내 Ca 안 저장고로부터 Ca 안 이 세포질로 동원되기 위해서는 외부 신호가 PLC 까지 전달되어 막 성분 중의 하나인 PIP 2 를 분해시켜 생성되 는 수용성 생성물인 lP 3 가 Ca2• 저장고 막의 lP3 수용체에 결합함 으 로 써 일어난댜 신호에 의해 증가된 세포질 내 자유 Ca 앙 은 Ca2• 의존 성 단백 질 키나제 를 활성화시켜 단백질의 인산화를 촉진시키는 것으로 보고되고 있댜 지금까지 식물 세포에서 보고된 Ca 인 의존성 단백질 키 나제 들 의 종류와 기능이 다양한데 이 내용에 관해서는 다음 절에서 자 세히 기 술할 것이다. 9-2 G- 단백질 동물 세포에서의 신호 전이를 논할 때 G- 단백질에 관한 언급을 하지 않 을 수가 없는데, 그 이유는 많은 신호 수용체들이 신호를 수용한 후 초 기 단계에서 G- 단백질을 경유하여 그 신호를 전달하기 때문이다 . 최근에 식물 세포에서도 G- 단백질을 통하여 신호를 전달하는 수용체들이 존재 한다는 실험적 결과들이 나타나고 있는 상황이다. G- 단백질이란 구아닌 뉴클레오티드의 결합에 의해서 그 활성이 조절되는 단백질로서, Rodbell 등이 1971 년 처음으로 이 단백질을 통한 신호 전이 경로롤 시사하였다. 지금까지 G- 단백질에 관한 연구는 주로 동물 세포에서 진행되어 온바 그 결과를 토대로 G- 단백질의 일반적 성질 및 종류 등을 기술하고 그 동 안 식물 세포에서 연구된 G- 단백질에 관하여 기술하고자 한다. 9-2-1 G- 단백질의 일반적 성질 G- 단백질의 경우 그 분자의 크기에 따라 크게 두 종류로 나누어진다.

분자량이 비교적 큰(약 80kDa) 이종 삼량체 (he t ero trirn e ri c) 의 G - 단백질 (af J r 소단위체)과 분자량이 작은 ras-lik e G - 단백질(약 20kDa) 인데, 이 절에서는 신호 전이에서 중요한 역할을 담당하고 있는 이종 삼량체 의 G- 단백질에 관해서만 기술하고자 한댜 세포의 원형질막에 결합하고 있는 신호 수용체와 직접 상호작용을 통하여 신호 전이에 참여하는 G- 단백질은 모두 이종 삼량체의 G- 단백질인데 , 8 r 소단위체 는 주로 막 이중층에 박혀 있으며 , a- 소단위체는 세포질 쪽으로 노출되어 GDP/ GTP 가 결합하는 부위를 가지고 있댜 수용체가 신호 를 받지 않았을 경 우 G- 단백질의 a - 소 단위체에는 GDP 가 결합되어 비활성을 나타내며, 수용체가 신호를 받고 활성화된 후 그 신호가 G - 단백질에 전해지면 G- 단백질의 입체 구조 변화가 일어나게 되고 그 변화는 G ― 단백질의 친화 력을 증진시키는 방향으로 일어나게 되어 a - 소단위체에 GTP 가 GDP 대신 결합하게 되며, 이때 G- 단백질은 활성화된댜 GTP 의 결합으로 활 성화된 G- 단백질은 그 옆에 결합되어 있는 eff ec t or 분자(주로 효소계)를 활성화시켜 그 다음 반응을 촉진시키게 된다. 신호 전달이 끝난 다음 다 시 비활성형의 GDP 가 결합되어 있는 G- 단백질로 돌아가기 위해서는 G- 단백질의 GTPase 기능에 의해 결합된 GTP 를 가수분해시켜 GDP 로 바꾸어 주는 것 이 다(그림 9-1). G- 단백질과 연결되어 있는 수용체로서 많은 연구가 되어 있는 것들은 /3-아들레날린 수용체들, a- 아들레날린 수용체들, 로돕신 그리고 무스 카린 아세틸콜린 수용체들이댜 G- 단백질들을 조절하는 수용체들은 대체 적으로 그 구조 및 기능 면에서 많은 유사성을 가지고 있다. 예를 들면, ® 분자량의 유사성 (40~50 kDa), (2) 막을 7 번 가로질러 통과하는 유사 성, ® N- 말단에 gly c o sy la te d res i due(s) 를 가지고 있는 유사성, @ c- 말 단 근처에 몇 개의 세린/트레오닌 잔기를 가지고 있는 유사성 등이다. 어떤 수용체이든 신호를 받으면 수용체는 활성형의 구조로 바뀌게 되 며, 활성화된 수용체는 a B r 소단위체가 함께 결합되어 있는 G- 단백

G- G DP \

질 과 높 은 친화력을 갖게 되며, 이때 a- 소단위체에 결합되어 있는 GDP 의 방 출을 촉 진시켜 GTP 결합 부위 를 비어 있게 만들고 GTP 와의 결합 력을 증진시킨다. a- 소단위체에 GTP 가 결합하게 되면 a- 소단위체와 /3 r 소단위체 간의 결합력이 약화되면서 a- 소단위체는 그들로부터 떨 어지게 되며, GTP 가 결합되어 있는 a - 소단위체는 eff ec to r 분자와 상호 작용을 하게 되며 이 분자 를 활성화시킨다. G- 단백질을 세포로부터 정제할 때 확인하는 동정 방법으로는 몇 가지 가 보고되고 있는데 , 첫째는 비가수분해성 GTP 유사체인 [r_l5S]GTP rs 의 결합으로 확인하는 방법이 있고, 둘째로는 G - 단백질의 경우 GTPase 활성도를 나타내는데 이 성질을 이용하여 결합된 [r- 허기 GTP 로부터 유리되어 나오는 32 p의 방사능을 측정하여 확인하는 방법이 있으

며, 셋째로는 GDP 또는 GTP 그리고 M g안과 같은 성분을 첨가하면서 트립토판 잔기의 형광 변화를 측정하여 확인하는 방법, 그리고 넷째는 박테리아 독소(콜레라 독소 또는 백일해 독소)들과 NAD 의 첨가로 ADP- 리보실레이션되는 것을 확인하는 방법 등이다. 위에 기술한 몇 가지 동 정 방법 중에서도 G ―단백질의 특이성을 확실하게 확인하는 방법이 독소 에 의한 ADP- 리보실레이션(그림 9-2) 인데, G 」단백질의 종류에 따라 리 보실레이션시키는 독소의 종류가 다르기 때문에 가능하다 . 9-2-2 G- 단백질의 종류 G- 단백질들은 그들의 a- 소단위체로 구별되면서 지금까지 보고된 바 에 의하면 9 개의 다른 유전자들이 a- 소단위체 를 발현시키는 것 으로 알 려져 있다. 그러나 G- 단백질들의 종류를 구분하여 명명하는 것은 a - 소 단위체와 상호 작용하는 effe c to r 분자(주로 효소계)들이 무엇이냐에 따 라 결정한다(표 9-1). 동물 세포에서 G- 단백질에 의해 조절되는 eff ec to r 분자들은 아데닐레 이트 시클라제 (AC), PLC, cGMP PDE, PLA .z 그리고 이온 수송로 (K, Ca2+ 수송로) 등이다. 아데닐레이트 시클라제를 활성화시키는 G- 단백질 과 상호작용을 하는 대표적인 수용체계로는 /3-아들레날린 수용체계 (ag o n ist : ca tec hol amin es) 인데 에피네프린 (e pi ne phri ne) 과 같은 호르몬이 수용체와 결합을 하게 되면 수용체는 G- 단백질 (Gs) 로 하여금 G sa 에 GTP 가 붙기 쉬운 입체 구조 변화를 유도하게 되며, Gsa 를 활성화시켜 아데닐레이트 시클라제를 활성화시키게 된다. 따라서 세포질 내의 cAMP 의 농도를 증가시키며 cAMP 의존성 단백질 키나제 (A 홉]나제)의 활성도가 올라가게 되고 단백질의 인산화 반응이 일어나게 된다. G 구간 백질과 연결된 신호 전달에서 가장 많이 연구된 수용체계가 시각 현상 의 신호 전달계인데, 이 현상의 광수용체 분자는 로돕신 (rhodo p sin ;

Adenosmeo_ 『O -O-l-oO· -CHk2 0 >: 망\ NH2 + 무( CNCII H=HN2 )H3 2+

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vita min A aldehy d e + p ro t e i n) 이며, 이 수용체와 상호 작용하는 G- 단백 질은 t ransduc i n(G1) 이고, eff ec to r 분자는 cGIYIP 특이성 포스포디에스테 라제 (PDE) 이댜 소의 눈 세포에서 정제한 G1a(39kDa), G1p (3 6kDa) 그 리 고 G1 r (8 kDa) 의 cDNA 들은 모두 클로닝 되 었다(표 9-1). G 를 통한 시각 현상의 반응 경로는 다음과 같댜 R 一hu R* . ― ➔ Gta GTP 一 PDE* 一 cGIYIP ! 一 Na • channel closure 一 membrane hyp erpola r iza ti on G - 단백질에 의해 활성화된 PDE 는 cGlVIP 의 수준을 감소시키게 되며 그 신호는 Na ♦ 채널에 전달되어 N 깊 채널을 닫히게 하는데 그 분자적 메커니즘은 확실시되고 있지 못하다 . N 깊 채널이 닫히게 되면 시각 세포 막을 중심으로 막 전위차가 생기게 되며, 이 전기적 신호가 신경세포로 전달되게 되는 것이다. 지금까지 열거한 두 가지 경우는 수용체에 의해 서 활성화된 G- 단백질의 신호가 eff ec to r 분자로 연결되는 대표적인 예 이고, 무스카린 아세틸콜린 수용체들과 연결된 G- 단백질의 경우 활성화 된 G ― 단백질의 신호가 이온 채널 (K • 또는 Ca2• 채널)들을 조절하는 기능 과 eff ec to r 분자계(아데닐레이트 시클라제 또는 PLC) 를 조절하는 기능 등 두 경우로 대별된다. G- 단백질이 이온 채널을 조절하는 경우 간접적 으로 조절하는 경우와 직접적으로 조절하는 경우로 나누어지는데, 간접 적으로 조절하는 경우 막에 결합된 효소계를 자극한 후 세포질 내 제 2 의 전령(예, IP3 또는 Ca2•) 수준을 조절하여 단백질 키나제의 활성도를 조절함으로써 채널 단백질의 인산화 조절을 통하여 이온 채널을 조절하 게 된다. G- 단백질과 직접 상호작용을 통해서 조절되는 이온 채널의 경 우 막의 탈분극화가 채널을 여는 필수적인 자극이 된다 . 이종 삼량체의 G- 단백질들 중 eff ec to r 분자의 활성을 억제시키는 기 능을 가지고 있는 G- 단백질(Gi)이 있는데 대표적인 것이 a2- 아들레날린

수용체와 연결되어 있는 G- 단백질이며, 이 G - 단 백질의 경우는 백일해 독소(pertu ss i s t o xi n) 에 의 해 ADP- ri bos y la ti on 이 되 는 것 으 로 알려 져 있 댜 a 2 - 아들레날린 수용체 외에 musca rinic cholinergic 수용체, dop a- mine 수용체, opi at e 수용체들과 연결된 G _ 단백질 들 이 G, 인데 eff ec to r 분자는 모두 아데닐레이트 시클라제이며 활성제가 이 들 수용체에 결합 할 때 G- 단백질은 아데닐레이트 시클라제의 활 성 을 억제하 는 방향으 로 반응을 진행시킨댜 G s 와 G i의 경우 Gp r 복합체는 같은 것 으 로 밝혀졌 으며, Ga 가 서로 다른 구조 를 가지고 있는 것으로 알려져 있댜 세포의 원형질막에 결합되어 신호 전이에 참여하는 이 종 삼량체의 G- 단백질은 분자량이 비교적 큰 G- 단백질들이고, 세포질 내에서 세포 분 열 등의 신호 전이에 참여하는 분자량이 비교적 작은 G - 단백질 들 이 있 댜 그 중 가장 대표적인 것이 ras 종양 유전자의 산물인 p21 단백질인 데 이들의 분자량은 21 kDa 이며, GDP / GTP 가 결합하는 단백질이댜 이 들 p21 단백질들의 아미노산 서열과 이종 삼량체의 G - 단백질 들 의 a - 소 단위체의 아미노산 서열은 상동 관계가 낮은 편이나 구아닌 뉴 클 레오티 드 결합 부위의 아미노산 서열의 상동 관계는 높은 편이다. 이상에 언급 한 G- 단백질들이 동물 세포에서는 그 연구가 상당히 진척되어 있는 반 면, 식물 세포에서는 이제 그 존재의 확인을 시작으로 그 기능 연구가 진행되고 있는 실정이다. 9-2-3 식물계 G- 단백질 식물계에서 최초로 확인된 GTP 결합 단백질의 경우는 Pisu m sat i- vum 에서 [35S]GTPrS( 비가수분해형 GTP 유사체)를 이용하여 확인하였 으며 (1), 그 후 Zucc hini의 배축 미크로좀 분획 (h ypo co ty l microsomal fr ac ti on) 에서 분자량이 작은 G- 단백질 (23kDa-28kDa) 들이 확인되었다 (2). 식물 세포에서 최초로 클로닝된 이종 삼량체의 G- 단백질은 Arabi-

dop s is t ha li ana 으로부터 얻었는데, 그 Ga1 단백질의 a- 소단위체의 아미 노산 서열과 동물의 것을 비교해 볼 때 36% 의 서열 상동 관계 를 나타내 었댜 식물 세포 들 의 경우도 다양한 신호(예 , 광선, 중력, 미생물 , 호르몬 등) 들 과 민감하게 반응하며, 생리 / 생화학적 연구 를 통하여 이들 반응에 대한 많은 정보 가 보고되어 있는데 반하여, 이 들 신호를 받아들인 후 진 행되 는 신호 전이의 반응 경로 및 반응 메커니즘에 관한 연구는 동물 세 포의 경우 와 비교하여 매우 초보적인 상태이다 . 최근에 식물계에서 신호 전이 과정을 이해하기 위하여 많이 이용하는 접근 방법 중 의 하나 는 신호 전이 반응에서 결함을 갖는 돌연변이체를 만 들 어 분석하는 것 인데, 이 연구 결과들로부터 신호 전이에 관한 생리 적 / 유 전적 정보는 비교 적 많이 얻고 있으나 , 신호 전이의 반응 메커니즘 에 관한 정보는 그 습득이 매우 부족한 상태이다. 생명체의 신호 전이 형태 는 매우 다양한데 그 중에서 가장 많이 연구가 되어 있는 경우가 세 포의 원형질막 표면에서 신호가 수용되며 그후 신호 전달 분자들에 의 한 생화학적 반응들을 통하여 그 신호가 전달되어 가는 경우인데 이때 신호 전달에 참여하는 중요한 분자가 G- 단백질이라는 사실은 부정의 여 지가 없다. 그러나 식물 세포의 신호 전이에서는 이 단백질의 참여 여부 조차도 확실한 상황이 아니다 . 그러나 최근에 식물 세포들에서도 호르몬 또는 광선 신호 전이 등에 G- 단백질이 관여할 것이라는 보고들이 나타 나고 있는 실정이다. Bossen 등 (4) 의 보고에 의하면 암소에서 성장한 밀 의 잎으로부터 분리한 엽육 (Meso ph yll) 세포가 적색 광선의 조사에 의해 그 부피가 증가하는 현상을 발견하였는데, 그 현상이 GDP /J S 에 의해 억제됨을 관찰하였다. 그와는 대조적으로 암소에서 또는 원적색광 조사 후 GTPrS 를 첨가해 보았을 때 세포의 부피 증가 현상이 적색광 조사 후 관찰되는 정도와 같게 나타남을 발견하였다. 이 사실온 Pfr 형의 피토 크롬이 세포의 부피 증가 (swe lli n g)에 관여한다는 증거를 제시함과 동시 에 어떤 메커니즘인지는 아직 확실치 않으나 피토크롬 신호가 G- 단백질

을 통하여 세포의 부피 증가 현상을 유발한다는 증거도 되는 것이다. 이 종 삼량체의 G- 단백질이 식물 세포의 원형질막에도 존재한다는 사실을 발견한 이후, 청색 광선에 의해 활성화되는 G - 단백질이 완두의 원형질 막에 존재함이 확인되었다 (5). G - 단백질(tr ansduc i n) 의 a 三 소단위체에 대 한 폴리클로널 항체(po l y clonal an ti bod y)에 의해 인지되 는 40l ill a 의 폴 리펩티드를 확인하였고, 이 펩티드가 콜레라 독소 (cholera t ox i n) 에 의해 ADP - 리보실레이션되는 기질이라는 사실도 확인하였다. 이 펩티드 (40 kDa) 가 콜레라 독소에 의해 리보실레이션(ri bos y la ti on) 되 는 능릭이 청색 광선의 조사에 의존성을 보인 사실은 이 펩티드 (40l ill a) 가 청색 광선에 의해 활성화되는 G_ 단백질의 a- 소단위체라는 사실을 확인한 것이다. 청색광을 조사한 시료에서만 비가수분해성 GTP 유사체가 이 펩티드에 결합한다는 사실이 확인되었는데, 이러한 결과들은 고등 식물에서도 신 호 전이에 참가할 수 있는 이종 삼량체의 G- 단백질이 세포의 원형질막 에 존재한다는 사실을 강력히 시사하는 것이다. 청색광 신호 전이에서 광수용체 분자가 어떤 것인가 아직 밝혀져 있지 않은 상황인데, 최근에 폴라보 단백질(fl avo p ro t e i n) 이 Pis u m sa ti vum 에서 청색광 수용체 역할 울 하여 이 식물의 원형질막에 GTPrS 의 결합을 중재할 것이라는 보고 가 있었다 (6). 식물의 성장과 분화에 청색광보다 중요한 광선이 적색 광 선이며, 적색광 수용체로서는 피토크롬이라는 색소 단백질(분자량 : 124 kDa) 이 모든 고등 식물에 분포되어 있다. 피토크롬에 의해 조절 받는 현 상은 매우 다양한데 그 모든 현상 발현 과정이 적색광 신호 전이 과정 이라고 말해도 과언이 아니다. 그런데 아직도 피토크롬 신호 전이 현상 에 G- 단백질이 관여한다는 실험적 사실들은 많지 않은 상태이다. 최근 에 귀리 세포에서 피토크롬에 의해 활성화되는 분자량이 작은 ras like G- 단백질 (24 kDa) 이 존재하는 사실이 보고된 바 있다 (7). 어떤 종류의 G- 단백질이 관여하는지는 모르지만 피토크롬에 의해 조절되는 대표적 인 유전자인 mb 유전자 발현에 G- 단백질이 관여한다는 사실을 대두의

세포에 콜레라 독소 / 백일해 독소와 같은 G- 단백질의 활성을 조절하는 박테리아 독소 를 세포 내에 넣고 cab 유전자가 발현되는 현상을 Nort he rn blot 방법으로 알아본 것이다 광 신호 전이(청색광, 적색광) 과 정에 G - 단백질이 관여한다는 사실 이외에도 Faba bean 의 공변세포의 K' 채널의 전류 흐름을 G- 단백질이 조절한다는 보고 (8) 와 Commelin a communis L. 의 기공의 개폐가 G - 단백질에 의해 조절된다는 사실도 최 근 에 발표되었다 (9). 이상 식물 세포의 여러 가지 현상 조절에 분명히 G ― 단백질 들 이 관여한다는 실험적 증거들이 제시되고 있으나, 아직도 식 물계에서는 관여하는 G - 단백질의 종류, 특징, 수용체와의 상호작용, eff ec to r 분자의 작용 등 구체적으로 해결되어야 할 문제점들이 그대로 남아 있는 상태이다. 9-3 이노시톨 인지질 대사 회로 식물, 동물, 미생물 등 거의 모든 생명체의 세포막을 구성하는 안지질 중 PI (4, 5)P2 (그림 9 一 3) 라는 인지 질이 소량 존재하고 있다. 세포의 신호 전이에서 이 인지질의 순환 대사 산물인 lP3 와 DAG 가 제 2 의 전령으로 서 중요한 역할을 담당하게 되는 것이다(그림 94). IP3 는 세포 내 Ca 안 저장고(소포체 또는 액포 등)의 막에 그 수용체가 존재하며, 이 수용체에 IP 따 결합하게 되면 저장고에 저장되어 있던 Ca 양이 세포질로 방출되게 되며, 증가된 Ca2+ 은 Ca2+／ 칼모듈린과 같은 단백질의 기능을 조절하거나, Ca2+ 의존성 단백질 키나제의 활성을 조절하여 단백질의 인산화 반응을 조절하게 된다. DAG 는 증가된 세포질 내 자유 Ca 안과 함께 단백질 키나 제 C(PKC) 의 활성을 증가시켜 단백질 인산화를 촉진시키며 그 후의 대 사 조절을 가능하게 하는 것이다. Boss 둥(1 0) 이 식물 세포에서 PIP2 의 존재를 최초로 확인한 이후 인지

CH1 - o-ic- R ,(16:0 )