그림 4-10 쿨로운 선택 모형의 항체 형성. B 림프구는 항원과 접하기 전에 이 미 표면 특이성을 가지고 있다. 막에는 단 한 종류의 항체만이 있는데, 이 항체가 항원과 결합하면 그 세포만이 증식하면서 동일한 항체를 형성한다 (Edelman, 1970) .

(A) (B)

그림 4-11 B 림프구 (A) 와 혈장 세포 (B). B 림프구가 항체 분비 혈장 세포로 분화 하면서 조면 세포체가 많이 발달한다.

기 전에 이미 림프구는 그 자체의 항원 특이성을 형성하고 있다. 각 림프구는 수백만 종류의 항체 중 한 종류만을 생성하여 이미 그 표면 에 항원특이성을 가진 항체를 준비하고 있다. 이러한 항원 특이성은 림프구가 분화하는 동안 새로운 유전자를 형 성함으로써 가능하다. 림프구 표면의 항체 단백질은 두 쌍의 폴리펩 티드 죽 한 쌍의 중사슬과 한 쌍의 경사슬로 이루어져 있다. 이들 사 슬은 이황화물 결합 (d i sul fi de bond) 으로 결합되어 있으며, 이러한 항 체 혹은 i mmuno g lobul i n 의 특이성은 변이부위 (varia b le re gi on) 의 아 미노산 배열순서에 따라 결정된다. 중사슬과 경사슬 모두에서 그 말 단은 아미노기 말단이 며 변이부위 가 고정 부위 (consta n t regi on ) 에 부 착되어 있다. 중사슬의 고정부위가 세포막에 삽입됨으로써 항체가 세 포 표면에 고정된다.

부항위체 결합 뿐 屈 결 합부 위

그림 4-12 전형적인 항체(imm uno g lobul in)의 구조. 두 개의 동일한 중사슬이 이황화 결합으로 연결되어 있다.

D量NA言 -DN+A -토 막 큰 토막의 작은 토막의 子〕겔 一절편冒 등:에 :이용: 충

그립 4-13 크기에 따른 DNA 토막 분리

중사슬과 경사슬의 유전자 모두가 림프구에 따라 다르게 형성된다• 우선 경사슬 유전자 형성에 대하여 살펴보기로 하자. 경사슬 유전자 는 크게 세 개의 부위 즉 변이부위, J부위, 및 고정부위으로 이루어 져 있다. 변이부위는 항체의 처음 97 개의 아미노산의 배열순서를 지 시하는 염기배열로 약 200 종이 있다. J부위는 변이부위의 마지막 15 ~17 개의 아미노산을 지시하는 염기배열로 4~5 종이 있다. 고정부위 는 언제나 일정하며 모든 림프구에서 공통적이다. 림프구 분화과정에 서 200 종의 변이부위 중 하나와 J부위 중 하나가 조합하여 항체의 변 이부위를 이루는데, 이때 V 부위와 J부위는 그 사이에 있는 인트론 (i n t ron) 을 제거시키면서 결합한다. 호주미 (Hoz umi)와 토네가와 (Tone g awa, 1976) 가 처음으로 이러한 유전자의 재배열을 보여주었다. 이들은 생쥐의 발생배와 특이한

V1 V2 V3 V, V; V0_1 V0 J1 ] 2 J, J, ], C

그림 4-14 B 림프구 분화중 일어나는 경사슬 유전자의 재배열 항원과의 결합 에 의해 촉진되기 전에 200 혹은 그 이상의 V 유전자 중 하나가 5 종류의 J 유전자 층 하나와 결합한 다음 고정 유전자 (C) 쪽으로 가까이 이동한다.

(A) 실험고안

(B) 결과 분자량 (x 10 ... )

그림 4-15 Hozum i와 Tone g awa 의 실험고안과 결과. 생쥐 발생배와 my el oma 의 DNA 를 BamHI 로 처리하여, 전기영동하고 분리 추출하였다. 각각의 DNA 시료를 항체 경사슬의 V 와 C 부위에 대한 mRNA(l) 그리고, 경사슬 단백질의 고정부위만을 지시하는 mRNA(2) 에 재결합시켰다. 발생배의 DNA 에서는 경사슬 단백질의 변이 (V) 및 고정 (C) 부위가 서로 다른 DNA 토막에서 발견되었으나, 림프구에서는 고정부위와 변이 부위가 동일한 DNA 토막 (2 .4 X 106) 에서만 함께 발견되 었다 (Hozum i and Toneg aw a, 1976).

i mmuno g lobu li n 을 다량 생 성 하는 경 사슬 분비 B 종양 세포로부터 DNA 를 추출하여 제한효소 Barn HI 으로 처 리하여 특별히 GGATCC 에서 DNA 를 토막내었다. 이들 DNA 토막들을 다시 겔 전기영동법 으로 크기에 따라 분리하여 전기영동 겔 절편으로부터 추출하고 변성 시킨 다음 원래 방사능으로 표지한 B 종양 세포의 전체 경사슬 RNA 와 재결합시켰다. 물론 고정부위에 대한 RNA 가 재결합하였으

나, 이 의에도 발생배의 DNA 는 겔상 두 군데에서 RNA 와 재결합하 는 것을 관찰할 수 있었다. 이때 재결합한 DNA의 분자량은 각각 6 X 106 과 3 . 9 X 10 6 이었다. 이들 DNA 를 각 각 고정부위의 mRNA 나 혹은 경사슬 단백질에 대한 전체 mRNA 와 결합시켜 보았더니, 고정 부위는 6 X 106 분자량의 DNA 에만 재결합하고 경사슬 전체 mRNA 를 사용하였을 경우에는 6 X 106 혹은 3 . 9 X W6 의 DNA 에 모두 재결합하는 것을 알았다. 이와 같은 결과로서 고정부위는 6x 1 06 DNA 에만 있고 변이 부위는 3.9 X l 06 DNA 와 6X 1 06 DNA 모두에게 있음 을 알 수 있었다. 그러나 림프구 종양세포의 DNA 는 발생배의 DNA 와 는 전혀 다른 실험결과를 보여주었다. 죽 경사슬 mRNA 에 결합할 수 있는 유일한 림프구의 DNA 는 분자량 2 .4 X 106 이었다. 2.4 X 1 06 DNA 는 고정부위 (C)RNA 와 결합하는 것은 물론 변이부위 (V) 와도 결합하는 것으로 보아 2.4 X 106 DNA 속에 C 부위와 V 부위의 DNA 가 모두 있는 것으 로 생각할 수 있었다. 이와 같은 실험결과는 아마도 두 개의 토막 죽 경사슬 C 부위의 한 토막과 V 부위의 한 토막이 결합하여 하나의 새로 운 유전자가 형성되었기 때문에 얻어진 것이라고 해석되었다 (Brack et al., 1978 ; Bernard et al., 1978 ; Seid m an et al., 1978, 1979) . 죽 림 프구 가 분화하는 동안 유전자 재배열에 의해 유전자가 새로이 형성된 것 이라고 생각되었다. 중사슬 유전자는 그 토막수가 경사슬의 유전자보다도 더 많고 분 화 과정이 다양하다. 중사슬 유전자는 V 부위, D 부위 J부위 및 고정 부위로 이루어져 있다. V 부위는 처음 97 개의 아미노산을 지시하는 부위로서 200 종의 다른 염기배열로 이루어져 있고 , D 부위는 3~14 아미노산울 지시하는 부위로서 10~15 종의 다른 염기배열로 이루어져 있으며, J부위는 15~17 아미노산을 지시하는 부위로 4 종의 염기배열 로 이루어져 있다. 그 다음으로 고정적인 C 부위가 연결되어 있다. 중사슬에서의 V 부위는 하나의 V 배열 부위와 하나의 D 배열 부위가

Bam HI : _부_위 - 1~+59규 X 王10 6 ―MW_ 칼_ _ _ ___ 「― 6 -X- DI0 -6 M -W-4 I ----------생 식세포 DNA

하나의 J배열 부위에 부착됨으로써 이루어진다. 이와 같이 중사슬의 V 부위와 C 부위는 림프구 분화중 형성된 두 개의 유전자로부터 지시 받아 형성된 것이다. 이때 항체의 C 부위는 세포막에 삽입되고 V 부위 는 항원 수용체로서 작용한다. 림프구가 항원과 접촉하게 되면 림프구는 분열하면서 항체분비 혈 장세포로 분화한다. 이들 세포에 의해 생성되는 항체에는 C 부위가 있다. 그러나 항체합성이 계속되면 C 부위는 변할 수 있다. 첫번째 C 부위를 mu 고정부위 (Cµ) 라고 하며, 두번째 C 부위는 분비될 때 다소 변경된 mu 자체이거나, Cr, Cc 혹은 Ca 부위이다. 그래서 중사슬의 변이 부위는 처음에는 µ고정부위에 나타나고, 다음에 r 고정부위에 나타난다. 이러한 현상을 class sw it c hi n g이라고 한다. 이때 고정부 위가 달라짐에 따라 중사슬의 작용양식에 변화가 생긴다. 즉 고정 부 위가 µ와 r 이면 항체의 분해, 응고 및 식세포에 의한 소화 등이 촉 진되고, €사슬이면 염증반응을 유도하게 되고, a 사슬이면 점액, 눈 물, 땀 및 젖으로의 항체 분비가 촉진된다. class s wt c hi n g은 변이부 위의 유전자 (VD J)를 止고정부위 앞에서부터 r, a, 혹은 €고정부위 앞으로 이동시킴으로써 성취한다. 이러한 접으로 보아 혈장세포의 유전적 조성은 다론 세포의 것과는 판이하게 다르다. 첫째로 림프구의 변이부위의 유전자를 구성하는

V, V0 D1 D0 J, J, S~ sz C, S\ s; C, S~ . S~ C0

그립 4-17 변이부위 유전자형성과 항체의 중사슬 생성중 일어나는 class swi tch ing , 중사슬유전자는 변이부위인 V, D, J와 고정부위 를 포함한다. 4 종류의 주요 항체는 고정부위에 근거하여 분류된다. 죽 I g A 는 요를 , IgM 은 Cµ 룰 그리고 I gG는 CT 를 포함한다. 변이부위는 한 개의 V, 한 개의 D 그리고 한 개의 J로 구성된다. 항체출현 이전에는 VDJ 유전자가 mu 고정 부위에 인접하면 , 이 항체는 세포막에 자리한다. 항제출현 이후에는 DNA 가 고리를 형성하면서 VDJ 유전자는 고정부위에 인접한다. 만약 pha 고정 부위에 인접하면 분비형의 항체가 된다. class sw it ch i n g은 고정부위 앞에 있는 일련의 swi tch 부위 (S) 에 의해 조절된다 (Dav i s et al. , 19soa, b).

DNA 토막둘이 다른 세포에서는 서로 떨어져 있으나, 림프구에서는 떨어져 있는 DNA 토막이 한군데에 모여 새로운 유전자로 구현된다. 둘째로 대부분의 혈장세포에서는 중사슬의 µ고정부위와 같은 게놈의 일부가 핵으로부터 제거될 수 있다. 죽 혈장세포에서는 유전적 조성 의 일부가 분화과정에서 결손될 수도 파괴될 수도 있는 반면에 새로 운 유전자가 탄생될 수도 있다. 대부분의 분화된 세포의 공통점은 유전적 조성은 동일하나 세포의 종류와 분화의 시기에 따라서 유전자의 발현이 선택적으로 일어난다. 그러나 림프구에서 나타난 유전적 조성 자체의 변화가 분화의 형태로

나타났다는 점은 대단히 획기적인 사실이라고 할 수 있다. 분화의 결 과로 나타난 유전적 조성의 변화는 분화의 결과가 단순히 선택적인 유전자 발현만으로 나타나는 것이 아니라 유전자 자체의 변화로도 나 타날 가능성을 강하게 암시하였다. 이러한 현상이 발생이 진행되면서 할구의 전능성을 제한하며 분화세포의 비가역적인 변화를 일으키는 것인지도 모른다. 2) 림프구 이외의 세포에서 유전적 조성의 변화 분화의 결과로 유전적 조성의 변화를 일으키는 예가 림프구 이외의 다른 세포에서도 관찰된 바가 있다. 말라리아 기생충인 Try pa nosoma bruse i에서도 유전적 조성이 바뀜으로 인해 새로운 표면 당단백질을 형성하는 예를 찾아볼 수 있다. 또한 효모균에서도 유사한 기구에 의 해서 교집 형 (mati ng type) 에 변화가 일어난다 (Hoe ij makers et al., 1980 ; Haber et al., 1980 ; Str a th e m et al., 1979). 죽 교집형은 교접형 유전자 (mati ng type gen e) 가 염 색 체 상에 위 치 하는 부위 에 따라 달라진다. 따 라서 제 1 대에서는 a 교집형 유전자가 on 위치에 있었지만 다음 대 에는 그 자리를 a 교집형 유전자와는 다른 a 유전자가 차지함으로써 교집형아 바뀌는 현상이 일어난다. 이때 이들 유전자들은 주로 세포 표면의 인식기구를 바꾸어 준다. 이러한 현상이 척추동물의 발생과정 에서도 나타나는 것으로 보아 아마도 이러한 바가역적인 유전적 조성 의 변화로 인하여 전능성이 상실되는 것인지도 모른다. 앞에서 설명 한 유전자 토막의 재조합 현상으로 유전적 조성이 변경되는 것 이의 에도 림프구 B 세포가 혈장세포로 분화하는 동안 많은 점 돌연변이 (po in t muta t io n ) 가 일어 남으로써 다양한 항체 형성 이 가능하다 (Crews et a l., 1981) . 유전적 조성을 변경시키는 또 하나의 특별한 예는 도약 유전자 Gump ing gen e) 혹은 트란스포손 (tran spo s on 혹은 tran spo s able ele- men t)인데, 트란스포손은 일종의 DNA 토막으로 이동하면서, 게놈

그림 4-18 옥수수 씨의 색소 유 전자 발현에 미 치는 t rans p oso n 의 효과 . 흰 부 위는 t ransp oson 에 의해서 색소유 전 자가 불 활성화 됨으 로 나타난 효과 이 다 (Pete r son, 1977) .

안으로 삽입되어 게놈의 염기배열순서를 바꾸어 준다. 트란 스 포손이 구조 유전자 사이에 삽입되면 구조유전자 는 불활 성화될 수 도 있다. 이러한 현상은 박테리아, 옥수수 (ma i ze), 초파리에서 그 예를 찾아볼 수 있다. 옥수수에서 씨의 색소유전자에 트란스포손이 삽입되면 무색 의 씨가 생성된다 (McC li n t ock, 1952 ; Pete r son, 1980). 그러나 이 트란 스포손이 그 위치에서 이동하면 색소합성이 회복된다. 초파리에서도 백색 유전자 (w hit e g ene) 에 트란스포손이 삽입됨으로 돌연변이가 일 어나는 경우가 있다 (Green, 1980 ; Gehrin g and Paro, 1980). 아직까지 트란스포손의 이동으로 발생의 방향이 정해지는지에 대하여 아 는 바 가 없으나, 트란스포손으로부터 mRNA 가 합성되는 것으로 보아 (Rubin e t al., 1980) , 트란스포손의 작용으로 발생 의 방향이 정 해 질 수 있을런지도 모론다는 가능성은 배제할 수 없다 (Sh i mo t ohno and Tem in, 1 980) . 3 순차적 유전자 발현 앞에서 설명한 게놈의 부분적 불활성화와 유전자 변경이 세포운명 결정에 대한 부분적 설명이 될 수는 있으나 모든 경우에 적용될 수

있을 만큼 보편적이지 못하다. 물론 이러한 현상에 대한 기구론적인 설명이 없기도 하지만 특수한 경우에만 그 설명이 가능할 뿐 모든 경 우 를 설 명할 수 있 을 정도의 일반성이 결여되어 있다. 그러나 순차적 유전자 발현 (D iff eren ti al gen e ex p ress i on) 은 아직까지 기구론적으로는 설명이 어렵지만 현상적으로는 가장 보편적으로 관찰되기 때문에 세 포운명의 결정에 가장 가능한 선택적 유전자 발현의 형태로 인식되고 있다. 분화된 세포는 그 종류에 따라 특이한 단백질을 합성한다. 즉 적혈 구 는 신경세포에서 찾아볼 수 없는 글로빈 단백질을 합성한다. 또한 발생배에 서 합성되는 단백질을 단계별로 보면 단백질의 양상이 다르 게 나타난다. 이와 같 은 공간적으로나 시간적으로 다르게 나타나는 단백질 합성 양상의 차이는 순차적 유전자 발현에 기인한다. 이것은 동일한 조성의 유전자가 발생과정을 통해서나 혹은 세포의 종류에 따 라 다르게 발현되기 때문에 나타나는 현상이다. 일단 발현되어야 할 유전자가 결정되면 발생의 방향 즉 세포운명이 결정된다. 그리고 결 정된 방향으로 세포는 분화하여 특정된 기능을 가전 세포가 된다. 여 기서는 순차적 유전자 발현을 몇 가지 예를 통하여 현상학적으로만 살펴보기로 하겠다. (I) 다사 염색체 순차적 유전자 발현이 발생단계에 따라 시간적으로 나타난다는 사 실을 가장 잘 보여준 예는 다사염색체 (po Mene chromosome) 에서 찾 아볼 수 있다. 다사염색체란 초파리나 Ch i ronomus 와 같은 쌍시류(雙 超羅 d ipt eran) 의 침샘세포에서 찾아볼 수 있는 특수한 염색체이다. 동원 체 (動原 體 , centr om ere) 의 응집 으로 형 성 된 염 색 질 핵 소체 (chromocente r ) 에 서부터 4 개 의 염 색 체 가 방사형으로 분포되 어 있고, 상동염색체가 짝을 이루고 있다. DNA 복제는 일어날지라도 염색체는

그 립 4-19 Drosoph i l a m e lano g as t er 의 침 샘 세 포의 다사 염 색 체

I 궐 I I' m I

분열하지 않은 내분열(內分裂 endo mit os i s) 을 하기 때문에 DNA 함 량이 512 배, 1024 배 혹은 그 이상으로 증가한다. 이러한 염색체는 그 후 더 이상 분열하지 않은 채로 남아 있게 되는데 그 크기가 거대하 여 광학 현미경 하에서도 관찰할 수 있을 정도이며, 가장 의미있는

특칭은 염색체상에 있는 대 (band) 이다. 초파리의 염색체에는 반배수 체의 게놈당 5150 개의 대가 존재하는데, 이러한 대는 무작위적으로가 아니고 규칙적으로 배열되어 있다. 대 사이에는 간대(i n t erband) 가 있 는데, 대와 간대의 차이는 DNA 의 농도에 달려 있다. 즉 염색분체가 대에서는 접혀 있는데, 이러한 접힘(fo ld i n g)의 모임으로 인해 대가 형 성되며, 염 색분체의 개 별적 인 접힘을 염색소립(染色小粒, chromomere) 이라고 한다. 간대에서 염색분체는 접히지 않은 채로 평 행적으로 분포되어 있다. 대를 구성하는 염색소립의 모양은 염색체를 인위적으로 잡아당겨 주었을 때 더 분명하게 나타난다. 조금 잡아당 겼을 때에는 염색소립의 모양이 잘 나타나나 좀더 세게 잡아당기면 염색소립의 모양을 상실하게 되는데, 접혀 있던 염색질이 풀려서 간 대와 비슷한 모양이 되기 때문이다. 비어만 (Beermann, 1952) 은 다사 염색체의 대의 모양이 일정하며 세포 종류에 따라 염색체 손실이 전 혀 일어나지 않음을 보여주었다. 그러나 그는 이러한 대가 부풀어 오 르는 현상을 관찰하였다. 이러한 부풀림 (p u ff)은 대를 구성하는 염색 소립이 풀려나오면서 부풀어오르는 것으로 그 크기가 염색소립이 풀 려나는 정도에 따라 다르게 나타난다. 비어만은 부풀림을 전사과정의 형태적인 표현이라고 생각하였는데, 여러 가지 유전학적인 연구를 통 해 대와 유전자간에 밀접한 관계가 있음이 발견되었다(J udd and Young , 1973 ; Swanson et al., 1981), Chir o nomus 침샘 염색체 4 번에서 거 대 한 부풀림 인 Balbia n i rin g 2 (BR2) 가 형 성 될 때 대 가 부풀어 오 르는 것을 관찰하였다(그림 4-21). 가장 간단하면서도 직접적인 증거 는 방사능 RNA 전구체로 유충을 처리하여 RNA 를 합성시킨 다음 자 기방사법으로 표지부위를 알아내는 것인데, 이러한 방법을 다사염색 체에 적용시켰을 경우 부풀림만이 선택적으로 표지되어 있음을 알 수 있었다. 그러나 전사 억제제인 a-ama niti n 이나 acti no my ci n D 를 처 리하면 RNA 전구물질의 표지가 부풀림에서 완전히 억제되었다 (Beermann, 1971 ; Holt a nd Kaijp er s, 1972) . 부풀림 이 풀려 나오는 것은

(A)

그림 4-21 Chir o nomus p all i di v itattatus의 침샘 염색체 4 번 기부말단에 자리한 Balbia n i ring 2 (A) 위상차 현미경사진 (B) 단계적으로 부풀고 있는 Balbia ni ring 2.

염색질을 전사시키는 여건을 마련하는 것이라고 볼 수 있는데, 전자 현미경으로 Balbia n i r i n g을 관찰해 보면 풀려나온 염색질에 전사활 동이 활발한 전사단위 (tran scrip tion al unit) 가 많이 있음을 찾아볼 수 있다(그립 4-2 2). 부풀립에서 mRNA 가 합성된다는 사실은 실험적으로 증명되었다. Chir Q n omus t en ta ns 에서 Balbia n i rin g 2 부풀립 (BR2) 은 그 크기가 대단히 크기 때문에 현미경 하에서 분리가 가능하다. BR2 를 분리하

그립 4-22 Chir o nomus p all id i v ittat us 의 침샘 염색체에서의 3H-u ridine 흡수에 미치는 a-aman iti n 의 효과. (A) 대조군 (B) a-aman iti n 을 처리한 염색체. N : 인, IV : 4 번 염색체에서의 Balbia n i rin g ( Beermann, 1971).

그림 4-23 Chir o nomus te n ta ns 의 4 번 염색체에서 발현중인 전사단위 (Lamb and Daneholt, 1979) .

여 전기영동법으로 분석하였는데, 75S 의 침강계수를 가진 50 , 000 개의 염기로 이루어진 대단히 큰 RNA 가 BR2 에서 합성된다는 사실을 알 게 되었다. 방사능 RNA 전구체로 RNA 를 표지한 다음 BR2 를 분리 하여 추출함으로써 얻은 순수한 75S RNA 를 염색체에 in sit u 재결 합시켜 자기 방사법으로 재결합 부위를 알아보았더니, 75S RNA 는 반드시 BR2 에만 결합되는 사실을 알 수 있었다 (Lambe rt, 1972 ; Lambert and Danholt, 191s). 75S BR2 ~NA 는 다른 RNA 와는 달리

BR 2

그림 4-24 Chir o nomus tenta ns 의 BR2 의 분리 (Lambert a nd Daneholt, 1975) .

핵에서 세포질로 이동하는 동안 그 크기가 감소하지 않는 것으로 나 타났다. 이러한 점은 RNA 를 분석하는 데 대단히 중요했다. 이와 같 이 거대한 RNA 가 리보솜과 결합하여 형성한 폴리솜은 거대할 것으 로 예측되었다. 침샘세포를 방사능 RNA 전구체로 표지한 다음 세포 질 폴리솜을 설탕 구배 원심분리 (sucrose grad i en t cen trifug a ti on) 로 분 석하여 보면 거대한 폴리솜울 얻을 수 있는데, 이 거대 폴리솜으로부 터 추출한 RNA 의 침강계수는 75S 였다. 또한 이 RNA 를 다시 염색

(A)

그림 .4- 25 Chir o nomus lenta n s 침샘 염색체 4 의 BR2 에서의 전사. (A) tolu id ine blue 로 염 색 한 염 색 체 . in vit ro 에서 의 RNA 합성을 시도하기 위 해 화살표 부위를 절단하였다. (B) 표지된 BR2 RNA 로 in situ 재결합시킨 다 음 자기 방사법으로 RNA 합성 부위를 검출하였다 (Lambe rt, 1972) .

`• 1

그림 4-26 Chir o nomus ten ta n s 4 번 염색체의 BR2 에서 얻은 거대 폴리솜의 전 자현미 경 사진 (Daneholt, et al. 1976)

70E

그림 4-27 Drosop hila melanog as te r 침샘 염색체의 3 번 영색체에서 단계에 따 라 일어나는 순차적 부풀림, A 와 B, 110 시간 유충, C, 115 시간 유충, D, O 시간 번데기. E, A 시간 번데기

체에 in sit u 재 결합시켜보았더니 BR2 에만 특별히 결합하였다 (W i es­ lander and Daneholt, 1977). 이 RNA 는 후에 침샘세포에서 단백질 합 성에 이용되고 있는데, 이와 같은 실험결과로 보아서 부풀림은 rnRNA 를 합성하는 형태적인 표현이라고 할 수 있었다. 부풀림은 조직의 종류에 따라 공간적으로 다르게, 발생 단계에 따 라 시간적으로 다르게 나타난다. 그림 4-27 은 Drosop hi la melanoga s - t er 의 침샘염색체 3 에서 일어나는 부풀림이 발생단계에 따라 다르게 일어남을 보여주고 있다.

(2) 성게 발생에서의 순차적 유전자 발현 성게 발생에서 유전자가 순차적으로 발현되는 사실을 핵산 재결합 법으로 알아냈다 (Galau et a l., 1976). 발생중 상당한 부분의 RNA 는 발생단계를 막론하고 공통적으로 존재하나 RNA의 일부는 단계에 따 라 그리고 조직에 따라 다르게 나타나는데 이러한 현상은 유전자의 순차적 발현에 기인한다. 이 실험은 성게 낭배의 mRNA 의 유전자인 유일성 DNA(uniq u e DNA) 에 여러 단계의 발생배나 종류가 다론 조 직에서 얻은 RNA 를 재결합시켜봄으로써 수행되었다. 이러한 DNA 를 낭배 특이 유일성 유전자라고 불렀는데, 그 복잡도 (com p lex ity)는 17 X 10 명기로서 마지막 단계의 난모세포의 mRNA 복잡도의 반 정 도에 해당한다. 우선 낭배로부터 세포질 RNA 를 추출하여 유일성 유 전자와 결합시킨다. 이때 RNA 는 완전히 순수한 mRNA 는 아니지만 일단 유일성 유전자와 결합시켜서 얻은 RNA 는 mRNA 로 간주할 수 있는데, 그 이유는 유일성 유전자는 구조 유전자 (s truc t ural g ene) 로서 직접 mRNA 를 전사시킴으로써 단백질의 아미노산 순서를 지시할 수 있기 때문이다. 유일성 유전자와 낭배 RNA 의 결합으로 이루어진 RNA - DNA 를 RNAse 로 강하게 처리하여중으로써 일단 DNA 에 결 합된 RNA 를 제거시킨다. 이와 같은 방법으로 얻은 DNA 는 낭배 mRNA 를 전사하는 부위로서 낭배 mDNA 라고 불렀다. 그리고 낭배 mRNA 와 결합하지 않은 DNA 를 낭배 null mDNA 라고 불렀다. 각 단계의 발생배와 여러 종류의 조직에서 추출한 RNA 를 낭배 mDNA 혹은 낭배 null mDNA 와 결합시킴으로써 낭배기에 발현되는 DNA 가 다른 발생 단계와 다른 조직에서도 공통적으로 발현되는지 혹은 낭배 기에서는 발현되지 않은 유전자가 다른 발생단계와 다론 조직에서는 발현되는지를 알아보았다. 그림 4-28 에서 회색대로 표시한 부분이 낭 배 mDNA 에 결합되는 정도를 그리고 백색대로 표시된 부분이 낭배 null mDNA 와 결합하는 정도를 나타낸다. 난모세포에서의 유전자 발

40I -·1

그립 4-28 여러 종류의 조직에서 mRNA 로 발현된 구조유전자. 회색대는 낭배 의 mRNA 와 동일한 mRNA 의 양을 의미하고, 비 회색대는 낭배 mRNA 와 다른 종류 mRNA 의 양을 의미한다. 복잡도 (com p lex ity)는 낭배 mRNA 의 복잡도를 100% 로 간주하고 산출한 것이다 . (Galau et a l., 1976)

현정도는 낭배에서 발현되는 것의 두 배로 난모세포에서는 낭배에서 발현되는 모든 유전자가 발현될 뿐만 아니라 낭배에서 발현되지 않은 유전자까지도 발현된다. 낭배 mDNA 와 재결합하는 포배의 mRNA 가 수정 후 포배기에 이 를 때까지 계속 전사되었을 가능성을 배제할 수는 없으나, 아마도 포 배의 mRNA 의 대부분은 난모세포에서 합성되었다가 수정 후 어느 정도 소모되는 것으로 보인다. 전반적으로는 난모세포에서 전사된 mRNA 종류가 수정 후 감소하는 경향을 보인다. 그러나 포배기에 아직도 낭배에 없는 전사체가 상당히 남아 있다. 낭배에 달하면 난모 세포에서 합성된 낭배 null mDNA 의 전사체는 완전히 고갈되고, 낭 배 mDNA 의 재발현을 유발함으로써 수정 후 감소된 낭배 mRNA 를

충당한다. 낭배 이후 낭배 mRNA 가 점차 고갈될 뿐만 아니라 낭배 null mDNA 가 발현함으로 낭배 의 것과는 다른 종류의 mRNA 가 합 성된다. 성체의 조직으로부터 얻은 mRNA 를 비교해 보면, 대부분의 낭배 mDNA 의 발현이 이러한 성체조직에서 위축되어 있다. 전반적 으로 보아 낭배 mDNA 가 공통적으로 발현되기는 하나 단계에 따라 또한 세포의 종류에 따라 특이한 DNA 가 발현된다. 아마도 공통적인 DNA 의 발현은 공통적인 대사과정을 위한 효소와 구조단백질에 대한 전사체의 합성과 관계되고 비록 양적으로는 적어도 특이하게 발현되 는 DNA 는 아마도 발생단계와 조직에 따라 특이한 형질 발현을 위한 단백질 합성과 관계되는 것으로 생각되었다. 성게 발생중에 나타난 유전자 발현은 공간적으로 선택적이다. 성게 의 게놈에는 6 종류의 액틴 유전자가 있는데, 이들 유전자 발현은 세 포의 계보에 따라 특이하게 나타난다. 그 중 한 개는 근육 액틴 유전 자 (M) 이고, 나머지 5 개는 세포 골격의 액틴 유전자 (C y)이다. M유 전자는 근육 세포에서만 발현되고 Cy I , Cy I la,Cy I lb,Cy lI Ia,Cy lI I b 등의 C y유전자가 발현되는 시기와 세포의 종류는 각각 다르다• Cy I 과 C y Il 는 발생초기에 포배 간충직 세포에서 그리고 배발생 후에 는 입부분을 구성하는 의배영과 장에서, 그리고 성체에서는 장과 관 족에서 발현된다. C y lll 는 발생 초기에는 동물극의 한 개의 세포로부 터 유래한 항문을 구성하는 의배영에서만 발현되고, 그 후에는 전혀 발현되지 않는다. 이러한 사실이 유전자 재조합법을 이용하여 확인되 었다 (Dav i dson et a l., 1985, 1986). 먼저 미수정란을 p ro tami ne 을 입힌 접시에 고정시키고 수천 개의 DNA 분자를 주사해 준 다음 수정시킨 다. 이때 의부에서 넣어 준 DNA 는 성게알의 핵 속에서 재조합되고 복제된다. 또한 열충격 단백질 (hea t - shock p ro t e i n) 에 대한 유전자를 박테 리 아의 chloramp he n ico l tran sfe r ase (CAT) 의 유전자에 재조합 시켜 성게알에 주사한 다음 발생시키면서 열충격을 주면 CAT 유전자 가 발현되어 CAT 효소가 생성된다. 죽 의부에서 주입된 유전자가 밖

에서부터 주는 자국에 대하여 반응을 보이고 조절될 수 있음이 확인 되었다. 이와 같은 실험방법을 이용하여 Cy매 a 유전자의 발현의 선택성에 대하여 데이비드슨 (Dav i dson) 등은 연구하였다. C y IIIa 유전자에 박테 리아 CAT 유전자를 재조합하여 성게의 미수정란에 주입시킨 다음 수정시켜 발생시켰다. 이 재조합유전자는 세포분열과 함께 복제되고 세포로 분배되기 때문에 내인성 Cyll la 유전자가 발현되는 시기와 세 포에서는 함께 발현될 것으로 기대되었다. 재조합된 C y Illa 유전자에 도 해독 개시코돈인 ATG 가 있지만 CAT 유전자에도 개시코돈이 있 기 때문에 C y llla 유전자의 발현 여부는 CAT 효소 를 검출함으로써 확 인이 가능하였다. 이러한 실험으로 C y Illa 유전자 발현은 수정 후 20 시간 이내에 최고조에 달하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 방사능 동위원소로 표지된 CAT 유전자로 in situ 재결합시켜 본 결과 CAT mRNA 의 합성은 항문을 구성하는 의배영에서만 선택적으로 일어난 다는 사실을 확인하였다. 이러한 실험결과로 보아 C y llla 유전자 발현 은 시간적으로 그리고 공간적으로 정확하게 조절되는 순차적 유전자 발현임을 알수 있었다. (3) 양서류 발생에서의 순차적 유전자 발현 사아젠트 (Sar g en t)와 다빗 (Da wi d, 19s3) 은 특정된 발생단계에서만 발현하는 유전자를 재조합하여 이용함으로써 양서류 발생과정에서 일 어나는 순차적 유전자 발현을 관찰하였다. 죽 Xenop us 의 낭배에만 존재하는 mRNA 를 추출 및 분리하여 이 mRNA 에 대한 cDNA 를 만든 다음 이 cDNA 에 다량의 난모세포 mRNA 를 첨가해 중으로써 낭배 mRNA 에 대한 cDNA 중 난모세포 mRNA 에 상보적 인 cDNA 는 모두 난모세포 mRNA 와 결합하도록 유도했다. 그 다음 결합된 cDNA mRNA 에서 mRNA 를 제거시킴으로써 수정 후 낭배기 이전

-DDDDDDDDDDCDDDD5DlLGGCGGGGGGGGGGGo .lC&274 7i865n這r IllJ . 24”O 66056』c271IeJ 6.5 포 배 8 o-•. ••.•-l••• .••。 ••••.•1•••0•.•..5 • •.••.•• ~••• .•.• H•• •..• i•• •.•.•j•••• .:••.••0•• .- ••.•••••• :. •.••• ••仁. ••••••.•• . ••••••산.• • •. ••1••.•• .••.•．••• H를.•.••••• • .•.•••~••'C ! ! ••. •••.. 쟁 •.•••. ,0 •.• •鬪•.• .•• . 9, T•.••P따

그림 4_29 X e no pt lS 의 발생 단계 에 따른 17 종류의 유전자 발현의 변화. 각 단계 로부터 추출한 RNA 와 방사능 동위원소로 표지한 DNA 를 dot blo tting법으 로 재결합시켜 유전자 발현 여부를 알아내었다 (Sar g en t and Daw id, 1983).

에 새로 발현된 유전자를 cDNA 의 형태로 분리해낼 수 있다. 이렇 게 분리된 cDNA 를 유전자 재조합법으로 증폭시켜 발생 단계에 따라 특이하게 발현되는 mRNA 의 종류를 알아내는 데 이용하였다. 이러 한 기술을 subtr ac ti on clo ni n g이라고 한다. 사아젠트와 다빗는 1 세 포기에서 tai lb ud s t a g e 에 이르는 발생배로부터 mRNA 를 단계별로 분리 하여 nit ro cellulose memberane fi l t er 에 s p o t하여 한 장의 filte r 에 모든 단계의 mRNA 가 포함되도록 하였다. 그 다음 subtr a cti on t echn iq ue 과 유전자 재조합법으로 증폭시키는 과정에서 방사능 동위 원소로 표지 한 낭배 특이 cDNA 에 mRNA 가 s p o t된 nitro cellulose filt er 를 넣 어 줌으로써 상보적 인 DNA 와 RNA 사이 에 재 결합이 이루 어지도록 하였다. 재결합되지 않은 cDNA 는 씻어버리고 결합된 cDNA 만울 자기 방사법으로 x-ray fi lm 에 옮겨 관찰함으로써 낭배 기 에 특이하게 발현되는 유전자가 다른 단계의 발생배에서도 발현되는

(A) (B) .

그립 4-30 성게의 의배영 특이 mRNA의 분포. 낭배중기 (A) 와 풀루티우스 유 생 (B) 에 분포되어 있는 의배영 특이 mRNA 를 in situ 재결합법으로 확인 하였다 (L ynn et al., 1983) .

지의 여부를 확인할 수 있었다. 그림 4-30 은 17 개의 유전자가 발생과 정중 어느 단계에서 특이하게 발현되는지를 dot blott ing 기술을 사용 하여 보여준 실험결과이다. 이들중 어느 유전자도 수정 후 7 시간의 포배 전이 (midb lastu la tr ans iti on) 시기 이전에 발현되지 않았다. 그러 나 DG64, DG39 와 같은 유전자는 포배 전이 시기직후 발현되기 시작 하였고, DG72, DG81 과 같은 유전자는 낭배중기에 발현되는 것으로 나타났다. 어떤 유전자는 일단 발현되기 시작하면 지속적으로 발현되 는 것으로 나타났고, 어떤 유전자는 그 발현이 순간적으로만 나타났 다. 그러나 지속적으로 발현되는 유전자도 앞으로 계속적으로 발현될 것인지는 알 수 없다. 이와 같은 Xenop us 의 예는 특별히 유전자 발 현의 시간적 선택성을 보여주는 좋은 예라고 하겠다.

참고문헌 Bemrnoaursde, i m0. m, oHuonzougm lo ib , uNlin: a lingdh t Tc hoanieng ga we n ae, s Sbe. f o( 1r9e 7 a8n) d. Safetq e ur e snocmesa toi cf chang e. C ell 15: 1133- 1 144. Brack, C., Hir a ma, M., Lenhard-Schuller, R. and Tonega w a, S. ( 1978) . A comp le te im munog lo bulin gen e is create d by somati c recombin a ti on . Cel l 15: 1~ 1 4. Brown, D. D. and Dawi d, LB. (1968). Spe c if ic gen e amp li fi ca ti on in oocyt es . Scie n ce 160: 272-280. Brown, S.W. and Nelson-Rees, W. A. (1961) . Radia t i on analys i s o f a lecanoid gen eti c sys t e m n. Geneti cs 46: 983- 1 007. Burkholder, G.D . (1976) . Whole mount electr o n mic r oscop y of pol yt en e chromosome from Drosop hi la melanoga s te r. Can. ]. Genet. Cyt ol. 1s: 67-77 . Burnett, F.M. (1959). The Clonal Selecti on Theory of Immunity . Vanderbil t P ress, Nashv ille . Cente r wall, W .R. and Benir s chke, K . (1973) . Male tor t oi s e shell and calico (T-C) cats . ]. Hered. 64: 272-278. Coop er , D. W., Vandeberg, J.L., Shannen, G.B. and Poole, W.E. (1971) . Phosph o g ly c e rate kin a se pol vrnorp h is m in kanga r oos pro - vid e s fur th e r evid e nce for pat e r nal X ina cti va ti on . Natu r e new Bio l. 230: 155-157. Crews, S., Griff in, J ., Huang, H., Calame, K. and Hood, L. (1981) . A sin g l e 따 gen e segm e nt encodes the im mune respo n se to pho sph o r- ylc holin e : Somati c muta t i on is correlate d wit h the class of the anti bo dy. Cell 25: 59-66.

Daneholt, B., Case, S.T., Hy de , J., Nelson, I and Weis la nder, L. (1976). Producti on and fate of Balbia n i rin g pro ducts . Prag. Nucleic Acid Res. 19: 319-334. Dav ids on, R.G ., Nit ow sky, H.M. and Ch ild s, B. ( 1963) . Demonstr a ti on of tw o po pu l ati on s of cells in the human fem ale hete r ozyg o us for glu cose-6-ph o sph a te dehyd r og en ase varia n ts . P roc. Natl. Acad. S ci . USA 50: 481-485. Davi s, M.M., Calame, K., Early, P.W. , L iv a nt, D.L. , Joh o, R., Weis s- man, I.L. and Hood, I. (1980) . An irn munog lo bulin heavy chain gen e is f orm ed by at least t w o recombin a ti on al events . Natu r e 283: 733-739. Davi s, M.M., Kim , S.K . and Hood, L. (1980) . Immunog lo bulin class swi tch i ng : Develop m enta l ly regu la te d DNA rearrange m ents durin g differ enti at i on . Cell 22: 1-2. Edelman, G.M. (1 970) . The stru c tu re and func ti on of anti bo die s . Sci . Am. 223 (2) : 34-42. Galau, G.A . , Klein , W.H., Davi s, M.M., Wold, B.J. , B ritt en , R.J. and Davi ds on, E.H. (1976) . Str uc tu ral gen e sets acti ve in embry o s and adult t issu es of the sea urchi n. Cell 7: 487-505. Gart ler , S.M. and Rig gs, A.D . (1983) . Mannalia n X-chromosome ina cti va ti on . Annu. Rev. Genet. 17: 155-190. Ga rtler , S.M., R ive st M. and Cole, R.E. (1980) . Cy tolo g ica l evi de nce for an ina cti ve X chromosome in mu rine oog on ia . Cyt og e n et. Cell Genet. 28: 203-207. Gehrin g , W. J. and Paro, R. (1980) . Isolati on of a hyb r id pla smi d wit h homolog ou s sequ e nces to a tran spo sin g element of Drosop hil a , melo ,no g as te r. Cell 10: 897-904. Green, M.M. (1980) . Transpo s able elements in Drosoph il a , and oth e r

dip ter a. Annue Rev. Genet. 14: 109-120. Grossbach, U. (1973) . Chromosome puffs and gen e exp re ssio n s in pol yt en e cells. Cold Spr ing Harbor Sym p. Quan t. Bio l. 38: 619-627. Hoeij m akers, J.H .J., Frasch, A.C.C., B ernards, A., borst, P. and Cross, G.A .M . (1980) . Novel exp re ssio n -lin k ed cop ies of the gen es for varia n t surf ac e anti ge ns in trypa nosomes. Natu r e 284: 78-80. Hozumi , N. and Tonega w a, S. (1976) . Evi de nce for somati c re- arrange m ent of im munog lo bulin gen es codin g for varia b le and consta n t regi on s. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 3628-3632. Jud d, B.H . and Young, M.W. (1973). An exami na ti on of the one cist ro n-one chromomere concept . Cold Spr ing Harbor Sym p. Qu ant. Bio l. 38: 573- 5 79. Kratz e r, P .G. and Chap m an, V.M . (1981) . X-chromosome reacti va - tion in oocy tes of Mus caroli. Proc. Natl . A cad. Sci. USA 78: 3093 -3097. Lambert , B. (1972) . Rep ea te d DNA sequ e nces in a Balbia n i rin g . J Mol. Bio l. 7 2: 65-75. Lambert, B . and Daneholt, B. (1975) . Mi cr oanalys i s of RNA from defi ne d cellular comp on ents . Meth o ds Cell Bio l. 10: 17-47. Ly on , M. F. (1961) . Gene acti on in the X-chromosome of the mouse (Mus mztS c ulus L.) . Natu r e: 190: 372-373. McClin t o c k, B. (1952) . Chromosome orga n i za ti on and gen i c e xpr e s- sio n . Cold Spr ing Harbor Sym p. Quan t. Bio l. 16: 13-47. Mi geo n, B.R. (1971) . Stu d i es of ski n fibr oblasts from ten familie s wit h HGPRT defi ci e n cy, wit h refe re nce to X-chromosomal ina cti va ti on . Am. J Human Genet. 2 3: 199-209. Mig eo n, B.R. and Jela lian , K. (1977) . Evi de nce for tw o acti ve X- chromosomes in gen n cells of f em ale befo re meio t ic entr y. Natu re

269: 242-243. Mohandas, T., Sp a rkes, RS., Helkuhl, B., Brzesch ik, K.H . and Shapi ro , L.J. (1980) . Exp re ssio n of an X-lin k ed gen e from an ina cti ve human X chromosome in mouse-human hyb r id cells: Fu rthe r evi de nce for the non-in a cti va ti on of the ste r oid sulfa tas e locus in man. Proc. Natl. Acad. Sci . USA 77: 6759-6763. Moore, K.L. (1977) . The Develop ing Human, Saunders, Phil a delph ia . Moss, T. (1983) . A tra nscrip tion al fun cti on for the repe t it ive rib o somal spa cer in Xenop us laevis . Natu r e 302: 223- 22 8. Pete r son, J.A . and Weis s, M. C. (1972) . Exp re ssio n of dif fere nti at e d fun cti on s in hep a to m a cell hyb r id s : Inducti on of mouse albumi n pro ducti on in rat hep a to m a-mouse fibr oblast hyb r id s . Proc. Natl. Acad. Sci . USA 69: 571- 57 5. Rubin , G.M., Brosein , W.J. , D unsmuir , P., F lavell, A.J., Lavis , R., Str ob el, E., Toole, J.J. and Young, E. (1980) . Cop ia-1 i ke tra nspo sa- ble elements in Drosop h ila gen ome. Cold Spr ing Harbor Sym p. Quan t. Bio l. 45: 619-628. Sarge n t, T.D . and Dawi d, I. (1986) . Differ enti al gen e expr e ssio n in the gas tru la of Xenopu s laevis . Scie n ce 222: 135-139. Seid m an, J.G ., Max, E.E . and Leder, P. (1979) . A im munog lo bulin gen e is form ed by site -s pe c i fic recombin a ti on wit ho ut furthe r somati c muta t i on . Natu r e 2so: 370-375. Sharman, G.B. (1971) . Late DNA rep lica ti on in the pa te r nally der- ive d X chromosome of fem ale kang a roos. Natu r e 230: 231-232. Sh im oto h no, K., and Tern in, H.M. (1980) . Evoluti on of retr o v iru ses from cellular moveable gen etic elements . Cold Spr ing Harbor Sym p. Quan t. Bio l. 45: 719-730. Spr a dlin g , A.C. and Mahowald, A.P. (1980) . Amp lifica ti on of gen es

for chorio n pro te i n s durin g oog en esis in Drosoph i la me lan oga s te r. Proc. Natl . A cad. Sci. USA 77: 1096-1100. Str at h e rn, J.N . , New ton , C.S ., Herskowi tz, I. and Hic k s, J.B . (1979) . Isolati on of a cir c ular deriv a ti v e of y ea st c hromosome. I ll. lmp li ca - tion s for the mechan ism of mati ng type int e r conversio n . Cell 18: 309-319. Swanson, C.P ., M erz, T. and Young, W.J. (1981} . Cyt o g e n eti cs: The Chromosome in Div is i o n , Inherit an ce, and Evoluti on , Second Edi· tion . Prenti ce -H a ll, Eng le wood Cli ffs, N J . Wats o n, J.D . (1976). Molecular Bio lo gy of the Gene, Th ird Edit ion . Benja m i n / Cummi ng s , Menlo Park, CA . Weis la nder, L. and Daneholt, B . ( 1977} . Demonstr a ti on of Balbia n i rin g RNA sequ e nce in pol ys o mes. ]. Cell Bio l. 7 3: 260-264.

제 5 장 순차적 유전자 발현의 조절 진핵생물에서의 세포분화는 시간과 공간에 따른'순차적 유전자 발 현에 기인한다고 할 수 있다. 발현될 유전자가 선택되어 전사된 다 음, RNA pro cessin g , 해독 및 후 해독과정을 거쳐 기능을 가전 단 백질이 만들어진다. 이러한 여러 과정을 거쳐 나타나는 유전자 발현 이 그 과정을 거칠 때마다 알맞게 조절됨으로써, 발생단계에 따라 그 리고 세포 종류에 따라 선택적 발현이 가능하다. 물론 유전자 발현의 조절기구가 현대 발생학에서 완전히 파악되기는 어렵지만, 이러한 문 제에 대한 개념적 이해를 돕기 위해서 우선 염색질의 물리적 구조와 유전자의 화학적 성질에 대하여 알아보는 것이 기본적으로 중요하다. 1 염색질의 구조 세 포주기 (cell cyc l e) 를 통해 염 색 체 의 크기 가 응집 (condensati on ) 정 도에 따라 다르게 나타난다. 세포분열기에 응집되고, 합성기 (S 기)에

그림 5-1 전자현미경으로 본 사람의 염색체 x2 9,6 0 0 (DuPraw. 1970)

풀린다. 그러나 풀리는 정도는 제한되어 있기 때문에 염색체를 이루 는 DNA는 핵 속에서 완전한 길이로 풀리는 경우가 없다. 인위적으 로 사람의 염색체를 풀어놓았다고 할 때 염색체를 이루는 DNA 의 길 이는 1. 4~7.3cm 에 달한다. 그러나 이러한 염색체는 세포분열 중기 죽 염색체가 가장 응집된 상태에 있을 때 2~lOX10-4cm 에 그친다. 죽 염색체를 이루는 DNA 길이의 1.4 ~36X 10-3 배로 그 길이가 줄어 드는 셈이다. 세포주기를 통한 염색체의 길이의 변화나 염색체 응집을 일으키는 물리적인 힘의 출처는 염색질의 화학적인 조성에 있다. 염색질은 DNA 와 히스톤(hi s t one) 단백질의 결합으로 이루어져 있다. 히스톤은 리신이나 아르기닌과 같은 염기성이며 양성으로 하전된 아미노산아 다량 들어 있어 단백질 전체가 염기성을 띠고 있다. 히스톤은 리신과 아르기닌의 양적 비율에 따라서 달라지는데, 리신이 아주 풍부한

Hl, 리신이 적당히 들어 있는 H2A 와 H2B, 그리고 아르기닌이 풍 부한 H3 와 H4 의 5 종으로 나뉜다. 일반적으로 동물, 식물 및 원핵 생 물에서 이 5 종의 히스톤이 공통적으로 발견되는데, 조류와 양서류의 적혈구와 같은 몇 종류의 세포에서 H5 가 발견되었다. H5 는 H1 을 대신하는 히스톤으로 H5 가 들어 있을 경우 DNA 의 응집정도는 대단 히 높다. 히스본의 역할은 DNA 와 결합하여 DNA 를 응집시키는 것 인데 , 염색질은 DNA 가 일정한 간격으로 꼬인 모양으로 나타난다. DNA 응집의 가장 기본적인 단위인 꼬임의 구조를 누클레오솜 (nucleosome) 이라고 한다. 누클레오솜은 직경이 125A 인데 단백질 분 해 효소인 트립신을 처리하면 구형(球形)의 모양이 풀리는 것으로 보 아서 이러한 구형의 누클레오솜 구조는 DNA 와 히스톤의 결합으로 인하여 생기는 구조임을 알 수 있었다 (Sahasrabuddhe and Van Holde, 1974) .

h (B) 누쿨레오솜

그립 5-2 누클레오송의 모형 (A) , 누곧레오송의 배열에 대한모형 (B) (Wolf e, 1983 ; Ste w art and Hunt, 1 982} .

누클레오솜의 구조를 알아내는 대 여러 가지 방법이 사용되었다. 가장 유용한 방법 의 하나는 염 색 질을 DNAse (micr ococcal nuclease) 로 처리한 다음 토막난 염색질을 관찰하는 것이었다. DNAs 여卜 아주 간 단히 처리한 다음 토막난 염색질을 설탕구배에 얹어 원심분리하여 얻

3

그립 5-3 누클레오솜 다량체의 특칭. (A) 쥐 간세포의 염색질을 DNAse I 으로 처리한 다음 설탕 농도구배로 분석한 결과 (B) 설탕농도구배로 분리한 4 개 의 pe ak 를 전자현미경으로 관찰한 결과 (C) 설탕농도구배의 각 pe a k.2로부 터 DNA 를 추출하여 전기영동으로 분석한 결과. 겔의 오른쪽 줄은 설탕농 도구배로 분리하기 전 DNAse 로 처리하여 전기영동한 것임 (Fin c h et al., 1975)

은 염색질 토막을 전자현미경으로 관찰하였다• 설탕구배를 260run 의 파장으로 scan 하여 여러 개의 p eak 를 관찰할 수 있었고, 각 p eak 의 염색질 토막을 전자현미경으로 관찰하여 몇 개의 누클레오솜으로 이 루어진 토막인가를 알아내었다. 다음 각 구배의 p eak 로부터 분리한 염색질 토막으로부터 DNA 를 추출하고 전기영동하여 한 개의 누클레 오솜울 이루는 데 필요한 DNA 의 염기수를 알아내었는데, 그 수는 200 염기쌍 (base p a i r) 에 달했다 (He wi sh and Burgo y n e , 1973 ; Noll, 1974). DNAse 를 처리한 염색질 토막을 전자현미경으로 다시 관찰해 본 결 과 200 개의 염기쌍을 가진 염색질 토막은 짧은 꼬리가 달린 구형의 모양을 가지고 있었고 400 개의 염기쌍을 가전 토막에는 두 개의 구형 체, 600 개의 영기쌍을 가진 토막에는 3 개의 구형체가 관찰되었다 (Fiu n ch et al., 1975). 따라서 누클레오솜 한 개는 200 염기쌍으로 이루 어져 있고, DNAse 에 의하여 200 염기쌍의 단위로 해체되는 것으로 풀이되었다. 그러나 DNAse 를 좀더 강하게 처리해 주면, 한 개의 누클레오솜에 관여하는 영기쌍 수가 점차 감소하는데, 감소의 한계가 140 염기쌍에 서 나타난다. 즉 140 염기쌍 이하로는 DNAse 에 의해 분해되지 않은 사실을 알게 되었다. 이와 같이 두 단계의 DNAse 를 처리한 다음 140 염기쌍과 결합되어 있는 히스톤을 분석하여 140 개의 염기쌍당 H2A, H2B, H3 및 H4 가 각각 두 개씩 들어 있음을 알 수 있었다 (Thomas and Kornberg, 1975). 즉 한 개의 누클레오솜은 140 개의 염 기쌍과 8 량체의 히스몬 (8 량체 =4 량체 X2) 으로 이루어져 있고, 200 개의 염기쌍 중 140 개를 제의한 60 개의 염기쌍은 은 누클레오솜 사이를 이 어주는 연결체 (li nker) 의 역할을 하고 있다. DNAse 로 강하게 처리하 기 전 200 개의 염기쌍을 가지고 있는 염색질 토막으로부터 단백질을 추출하여 분석해 보면 4 종류의 히스톤의에 Hl 이 들어 있음을 알 수 있었다. 즉 연결체인 60 개의 염기쌍에 Hl 이 결합되어 있다. 시험관 에서 히스톤과 DNA 를 적절한 조건 하에 둠으로써 누클레오솜을 인

위적으로 합성시킬 수 있었다 (Kornber g and Thomas, 1 97 4) . 우선 H2A, H2B, H3 및 H4 를 섞 어 주면 H2A 와 H2B 의 4 량체 및 H3 와 H4 의 4 량체가 형성된다 . 여기에 DNA 를 넣어 주면 물리적 및 화학 적인 성질이 정상적인 누클레오솜과 동인한 구조를 형성한다. 이와 같은 결과로서 DNA 가 히스톤의 8 량체를 둘러싸서 누클레오솜을 형 성하며 누클레오솜은 일정한 간격을 가지고 반복되는 것을 알 수 있 었다.

(A) ’ ’

그림 5-4 염색질을 응축시키는 Hl 히스돈의 역할. (A) 닭의 간세포로부터 추 출한 염색질 (B) Hl 만을 제거시켰을 때의 영색질 (Ou tl e t et al., 1975)

Hl 은 연결체에 결합되어 있는데, Hl 이 결핍될 경우 염색질에 구 조적인 변화가 일어난다. 핵에서 직접 얻은 염색질을 전자현미경으로 보면 대단히 심하게 응집되어 있는 염색질을 볼 수 있는데, 만약 Hl 울 제거시키면 염색질은 상당히 긴 연결체에 누클레오솜이 비교적 잘 드러나는 모양을 가진다. 이러한 점으로 보아서 Hl 은 특별히 염색질 울 응집시키는 것으로 생각된다. 세포분열시 일어나는 염색체의 응집 현상은 Hl 히스톤에 의해서 가능한 것으로 보인다. 또한 진정 염색 질과 이질 염색질에 응집 정도의 차이가 있는데 이것도 Hl 의 변화에 의하여 조절되는 것으로 생각되고 있다. 이와 같 이 염색질은 누클레오솜이라는 단위로 일차적으로 꼬여 있 으나 꼬임은 그 위에 여러 차례 가중되어 핵 속에서의 염색질의 구조 는 복잡하다. 그러나 이들 염색질을 이루는 DNA 로부터 선택적으로 유전자가 발현된다. 누클레오솜은 고르게 염색질을 따라 형성되어 있 고 누클레오솜에 관여하는 히스톤의 성분이 동일한 것으로 보아 누클 레오솜 자체가 선택적인 유전자 발현에 조절 역할을 할 것이라고 기 대하기는 어렵다. 히스몬이 DNA 에 강하게 밀착되어 있는 한 DNA 는 전사되지 않는 다. DNA 가 전사되기 위해서는 우선 RNA 중합효소가 DNA 에 부착 되어야 하는데, 누클레오솜이 있는 한 RNA 중합효소의 부착은 불가 능하다. 그러나 누클레오솜에 변화를 주면 RNA 중합효소의 부착이 가능해지고 DNA 는 전사된다. 2 진핵세포 게놈의 특징 진핵세포의 게놈과 원핵세포의 게놈 사이에는 구조적인 면과 기능 적인 면에서 대단한 차이가 있다. 이러한 차이는 유전자 발현의 조절 기구의 차이룰 반영하는 것으로 진핵세포 게놈의 특칭을 이해하는 것

은 중요하다. 진핵세포의 게놈은 일반적으로 원핵세포의 게놈에 비하 여 엄청나게 크다. 예를 들어 Esclwr ich ia col i의 게놈의 크기는 4. 2X10 명기쌍인 데 비하여 사람의 게놈크기는 3 . 3X10 명기쌍으로 거 의 800 배나 더 크다. 게놈 크기 (ge nome s i ze) 는 반배수체의 염색체에 들어 있는 DNA의 함량을 길이, 무게, 혹은 염기쌍의 수로 표시한 것이다. 그러나 놀라운 사실은 비록 원핵세포의 게놈 크기가 작을지 라도 진핵세포에서 합성되는 효소를 거의 모두 합성한다는 것이다. 전통적인 유전학적 방법으로 사람의 유전자의 수를 산출해 보면 약

>100 -포유류

그립 5-5 여러 종의 생물의 게놈 크기 비교 (Ra ff and Ku nfma n, 1983).

5 X l 어 정도라고 하는데 사람의 게놈 크기로 최소한도 2 X 106 개의 유 전자가 이론적으로 가능한 점으로 보아 진핵세포의 게놈 크기가 필요 이상으로 크다는 점을 알 수 있다. 그러나 이러한 현상이 세포분화의 관점에서 볼 때 어떠한 의미를 가지는지는 아직 분명치 않다. 또한 고등한 동물의 게놈 크기가 하등동물의 것보다 일반적으로 크다는 사 실을 알 수 있다. 그러나 양서류와 같은 종류에서는 게놈 크기의 폭 이 대단히 크다. 특별히 도롱뇽의 게놈 크기는 사람의 것보다 100 배 이상이나 크다. 이러한 현상은 양서류가 사람보다 더 많은 유전자를 필요로 하는 것이라고 보기는 어렵다. 3 DNA 재결합 진핵세포의 DNA 의 특징을 알아내는 데에는 DNA 재결합법 (DNA rena t ura ti on) 을 이용해 왔다. 이 방법은 DNA 이중나선의 상보성을 이용한 것인데, 단일 나선의 DNA 조각들이 농도와 시간에 따라 재 결합하는 속도를 기준하여 동일한 염기서열을 가진 DNA 의 반복정도 를 측정함으로써 DNA 를 분류할 수 있다. 그러나 동일한 염기서열을 가진 DNA 의 재결합이 빠른 속도로 일어나기 때문에 일단 재결합반 응이 부분적으로 일어나면 나머지 부분의 재결합반응은 물리적으로 불가능해진다. 일정한 길이로 DNA 를 토막내지 않으면 동일한 서열 울 가진 DNA 토막끼리의 충돌을 좀더 효과적으로 유발시킬 수 없다. French p ress 나 초음파분쇄기 (ul tr aso ni ca t or) 를 이용하여 450 염기쌍의 크기로 DNA 를 토막낸 (shea ring) 다음 90° 이상의 열을 가하든가 알칼 리를 처리하여 단일나선으로 변성 (dena tur e) 시켜준다. 열을 이용하여 이중나선을 결합시키고 있는 수소 결합을 끊어중으로써 DNA 가 변성 되는 것인데, 이때 온도 변화의 중간 온도를 DNA 의 융점 (mel ting tem p er atu re, Tm) 이라고 한다. 변성 직후 온도를 Tm 에서 20~25° 이 하로 떨어뜨려 주면, DNA 토막들이 짝을 찾아 재결합하기 시작한

다. 재결합 정도를 측정하는 데에는 두 가지 방법이 있다. 파장 26orun 에서 DNA 는 변성 정도에 따라서 파장 흡수도가 달라진다. 이 률 hyp o chromi c sh ift라고 하는데 변성 전 DNA 의 흡수도에 바 하여 약 40% 가 증가한다. 따라서 재결합 반응에 따라 감소하는 흡수도로 부터 재결합 정도를 산출해낼 수 있다. 또 다른 방법으로는 hydroxy a p a tit e( 일종의 calciu m p hos p ha t e) 를 이용하는 것이다. hy drox y a p a tit학근 인산 완충용액 (ph osph a te bu ff er) 의 낮은 농도에서 는 단일 나선만을 통과시키고 이중나선을 보유하며, 높은 농도에서는 이중 나선까지 모두 통과시키는 성질을 가지고있다. 일정한 시간 동 안 반응한 DNA 용액을 hyd r oxy ap a t i te column 에 얹어 단일 나선과 이중 나선을 분리하여 각각을 측정함으로써 재결합 정도를 측 정할 수 있다. 재결합 반응은 상보적인 두 종류의 분자간에 일어나는 것이므로, 그 반응속도가 이 차 반응속도 (second order reacti on ) 를 따른다. 반응 속도는 반응시간과 DNA 의 농도에 따라 변한다. 반응시간을 오래 끌 면 재결합 정도가 시간에 따라 증가할 것이고 DNA 농도를 높이면 재결합 반응속도가 빨라진다. 따라서 재결합 반응속도는 반응시간과 DNA 농도의 복합적인 요인에 의해서 좌우된다. 재결합 반응을 시작 할 때의 DNA 농도 (Co) 에 시간(t)을 곱해준 Co t를 기준으로 반응속 도를 평가함으로써 한 종류의 DNA 를 염기서열의 반복 정도에 따라 분류하거나 혹은 서로 다론 DNA 를 비교할 수 있다. 만약 한 게놈에 서 염기서열의 반복정도가 높은 DNA 부위가 있다면 이 부위의 DNA 토막의 용액내에서의 농도는 높을 것이고 반응속도도 빨라진다. 따라 서 Co t값이 낮을 때 이미 반복적 인 DNA의 재 결합은 끝난다. 반대 로 거의 반복성이 없고 유일하게 게놈 속에 존재하는 부위의 DNA 토 막의 농도는 대단히 낮을 것이므로 반응속도는 엄청나게 느리다. 따 라서 Co t의 값이 높은 때에만 이러한 DNA 의 재결합 반웅이 일어난 다. 이와 같이 재결합법으로 게놈내의 DNA 의 반복정도에 따라

DNA 를 분류할 수 있다. 즉 DNA 를 이루는 영기서열의 복잡도 (DNA com p lex ity)를 알 수 있다. 또한 이러한 방법으로 게놈의 크기 도 알아낼 수 있다. DNA 복잡도는 생물의 종류에 따라 다른데, 특 히 진핵세포와 원핵세포 사이에는 뚜렷한 차이가 있다. 만약 영기배열 순서가 반복되지 않고 유일하게 존재하는 유일성 DNA의 경우에서는 재결합 반응에 대한 Cot curve 가 두 단계의 log ar ith m i c scale 에서 표현된다. 그러나 유일한 배열순서의 DNA 만 이 아니라 여러 단계의 반복정도를 가진 반복 배열 순서의 DNA 의 Cot curve 는 더 광범위한 log a rith m i c scale 에 넓게 퍼져서 나타난다. 우선 유일성 DNA 에서의 재결합반응의 예를 들어 보기로 하자. 원 핵세포의 DNA 는 거의 모두가 유일성 DNA 이므로 2 단계에 걸친 이 상적 인 Cot curve 로 재 결합 반응을 일으킨다. 박테 리오파아지 인 T4 는 1.5 X 10 명기쌍의 게놈 크기를 가전 DNA 이고, E. co i l 는 4.2X106 염기쌍의 게놈크기를 가전 DNA 이다. 이들 DNA 의 재결합은 모두 이상적인 Co t곡선을 따라 일어나는데, 반응이 일어나는 Co t의 영역 이 게놈 크기의 차이에 따라 다르게 정해진다. T4 의 Co t곡선이 E.

。

그립 5-6 이상적 Co t곡선. 백분율로 나타낸 재결합 정도를 DNA 의 농도와 시 간의 곱인 Co t에 따라 그리면 두 단계의 log ar it hmic scale 에 분포하는 그 립이 나온다 (B ritt en and Kohn, 1968}.

。

Col i의 것에 비해 낮은 Co t영역에서 일어난다. 이러한 Co t영역의 차 이룰 직접 비교하기 위하여 Co 담 (hal f Co t)를 이용하는데, 재결합이 50% 까지 일어났을 때의 Co t의 값을 Co t卓이라고 한다. T4 DNA의 Co t21一 는 0.3 mole x sec/l it er 이며 E. coli D NA의 Co t1j 는 T 4 의 30 배인 10 molexsec/l it er 이다. 따라서 한 종류의 게놈 크기를 알면 Co t곡선을 비교하여 다른 종류의 게놈 크기를 알 수 있다. 이러한 게놈크기의 산출은 사실상 이상적인 Co t곡선을 가지는 DNA 에서만

100

가능한데 그 이유는 반복정도의 차이로 DNA 의 Co t곡선이 두 단계 이상의 log ar ith m i c scale 에 걸쳐 나타나 사실상 Co t- 21 로 게놈 크기 를 비교할 수 없기 때문이다. 일반적으로 진핵세포 DNA의 Co t곡선은 크게 3 부분으로 나뉘어진 다. Co t곡선 전체는 6~7 단계의 !og ar ith rn ic scale 에 분포되어 있다. Co t값이 낮은 부위에서 재결합된 DNA 는 대단히 반복적인 것으로 반복정도가 106 이다. 이러한 DNA 는 전사되지도 않고 단백질합성에 있어서 아미노산 서열을 지시하지도 않는 것으로 세포분화와 관계가 없다. 염색체내에서는 주로 동원체 부위에 자리하면서 세포분열시 영 색체 를 보존하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

이 러 한 반복 DNA 를 때 로는 위 성 DNA(sate ll ite D NA) 라고 하는

그림 5-10 분석 초원심분리에三 의한 생广쥐 DN A 의 부력 밀도. 1. 72 7 의 DNA 는

와 다르게 나타난다. 이러한 위성 DNA 가 반복성 DNA 이다. 이러한 사실은 반복성 DNA 를 h y drox y a p a tit e 로 분리 하여 부력 밀도를 측정 해 보면 위성 DNA 와 동일하게 나타나는 것으로 보아 알 수 있었다. 생쥐에서 가장 반복적인 DNA 는 전체 DNA 의 약 10% 에 해당하며 106 의 반복정도를 나타내고 있다. Co t곡선의 마지막 부분에 나타나는 DNA 는 반복성이 거의 없기 때문에 재결합속도가 느리다. 이러한 DNA 를 유일성 DNA 혹은 비 반복성 DNA(non-r e pe a te d DNA) 라고 하는데 , 이 DNA 는 대 부분의 효소와 구조 단백질의 합성을 지시하는 유전 정보를 가지고 있다. 유 일성 DNA 는 한 게놈당 1 회 혹은 2~3 회 이상 반복하지 않는다. 포 유류에서 게놈당 50% 이상이 유일성 DNA 에 속한다. 만약 mRNA 룰 분리하여 DNA 에 재결합시키면 mRNA 는 유일성 DNA 에 특이하 게 결합하는 현상을 찾아볼 수 있다 (Goldlber g et a l., 1973), 적혈구로

부터 헤모글로빈 mRNA 를 추출하여 DNA 와 재 결합시 키면 거의 대 부분이 유일성 DNA 와 결합한다 (Dav i dson and Bri tten , 1973). 그러나 히스톤 mRNA 의 경우는 다르다. 히스몬 mRNA 는 다소 반복성 DNA(moderate ly repe a te d DNA) 와 결합하는데 히스톤 DNA 는 수백 배에 해당하는 반복성을 지니고 있다 (Kedes, 1976). 유일성 DNA 가 구조 유전자 (s t uc t ural g enes) 에 해당한다는 사실은 mRNA 와의 재결 합 실험에서뿐만 아니라 mRNA 에 대한 cDNA 와 DNA의 재결합 실 험 에서 도 나타났고, DNA 재 조합법 (recombin a nt DNA meth o d) 을 이 용하여서도 확인되었다. 특정 구조 유전자를 진핵세포의 유전자로부 터 분리하여 DNA 재조합법으로 증식시킨 다음 DNA 와 재결합시켜 봄으로써 구조 유전자는 유일성 DNA 로 구성되어 있음을 알 수 있었 다. DNA 의 세번째 부류로서는 다소 반복성 DNA 를 들 수 있는데, Co t곡선에서 중간부분에 나타나는 DNA 로서 반복성도가 103~105 이 다. 포유류에서는 게놈당 15% 가량이 이 범주에 속한다. 다소 반복 성 DNA 중 지금까지 알려진 구조 유전자로서는 히스톤 DNA 뿐이며 대부분의 다소 반복성 DNA 는 단백질 합성 지시 역할을 하지 않는 다. rRNA 나 t RNA 에 대한 유전자가 다소 반복성 DNA 에 속하는 것으로 알려져 있는데, 이러한 DNA 는 비교적 한군데 모여 있으며, 일정한 간격을 두고 반복되는 것이 특칭이다. 43 종의 t RNA 에 대한 유전자는 각 유전자당 평균 200 회 반복함으로써 전체로서는 8600 tR NA 유전자가 존재한다 (Clarkson et a l., 1973). 5S, 18S, 28S 의 rRNA 의 DNA 도 다소 반복성 DNA 에 속하는데, 특히 l8S 와 2sS rRNA 의 유전자에 대 한 연구가 많이 되 어 있다. rRNA 유전자는 염색체상에서는 인 형성체 (nucleolar or g a ni zer) 부위 에 위치하고 있는데, 수백회 반복되어 있다. 대개의 경우 인 형성체 가 반배수체의 염색체 중 하나만 존재하는 것이 보통인데 그 예를 Xenop us 나 초파리에서 찾아볼 수 있다. 인 형성체의 위치는 rRNA 와 염색체의 DNA 간의 in situ 재결합법과 자기방사법으로 밝혀졌다

(Pardue, 1973). rDNA 는 염색체상에 산만하게 퍼져 있는 것이 아니 고, 한군데에 집중적으로 모여 있다. t RNA 와 rRNA 의 유전자가 특정된 위치에서 반복되는 반면에 나 머지 다소 반복성 DNA 는 유일성 DNA 사이에 산만하게 흩 어져 있 다는(i n t erd i s p erse) 사실이 밝혀졌다. 대부분의 유일성 DNA 는 다소 반복성 DNA 로 둘러싸여 있다 (Dav i dson, 1973 a and 6). 이러한 사실 은 이중 재결합 실험 (double renatu r ati on exp e ri men t)을 통해 증명되 었다. 우선 DNA 를 3700 염기쌍의 크기로 토막을 내고 단일 나선으 로 변성시킨 다음 다소 반복성 DNA 와 재결합할 수 있는 정도의 Co t수준까지 재결합 반응을 허용한다. 재결합된 이중나선의 DNA 토막둘을 hy drox y a p a tit e 로 분리한 다음 다시 변성시키고 450 염기쌍 의 크기로 토막낸다. 이들 DNA 토막을 한번 더 재결합시켜 보았더 니 45% 만이 이중나선을 형성하였다. DNA 토막의 길이가 길수록

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그람 5-11 유일성 DNA 와 다소 반복성 DNA 의 산재성. DNA 가 hyd rox- y a p a tit e 에 붙둘리는 대에 DNA 토막의 크기가 미치는 영향을 조사함으로 써 유일성 및 다소 반복성 DNA 의 산재성을 알아내었다 (Da vi dson , 1973}.

이중나선 부위에 붙어 있는 단일 나선의 길이가 긴 것을 전자현미경 으로 확인할 수 있었다. 즉 DNA 토막의 길이가 짧을수록 다소 반복 성 DNA 와 유일성 DNA 가 h y droxy a p a tit e 에 의해 분리되는 점을 관찰할 수 있었다. 이러한 실험결과는 다소 반복성 DNA 와 유일성 DNA 가 서로 나란히 자리하고 있기 때문에 나타나는 것으로 해석되 었다.

I I

그립 5-12 전자현미경으로 관찰한 유일성 및 다소 반복성 DNA 의 산재성 (Dav ids on et a l., 1973) .

다소 반복성 DNA 의 산재성 (散在性 i n t er di s p ers i on) 은 전자현미경에 의해서도 확인되었다 (Chambela i n et a l., 1975). 2500 염기의 Xenop us DNA 토막을 낮은 Co t까지 재결합시킨 다음 전자현미경으로 관찰하 였다. 이중 나선으로 재결합된 대부분의 DNA 토막둘은 H 자 모양 즉 이중 나선 부위 양쪽에 단일 나선의 꼬리가 달린 모양을 하고 있 었다. 이중 나선 부위는 다소 반복성 DNA 에 해당하며 단일 나선 꼬 리는 유일성 DNA 에 해당하는 것으로 풀이되었다. 이러한 다소 반복 성 DNA의 산재성은 Xenop us 에서뿐만 아니라 비록 그 양상에 다소 차이가 있으나 초파리, 성게, 곰팡이, 쥐의 DNA 에서도 발견되었다 (Mann ing et a l., 1975 ; Klein , e t a l., 1978 ; Consta n ti ni et a l., 1978 ; Kimme l and Fir tel. , 1 979 ; Zucker and Lod ish , 1981) . 다소 반복성 DNA 의 기 능 에 관해서는 아직까지 확실치 않으나 이 DNA의 전사체가 주로 핵

속에 남아 있으면서 해독되는 경우가 거의 없는 것으로 알려져 있다 (Ry ffel et al., 1981). 아마도 이들 전사체들은 유전자 발현의 조절 역 할을 담당할 것으로 짐작되어 대단한 주목을 끌고 있다. 4 순차적 유전자 발현의 조절요안 대부분의 유전자는 손실되거나 변경됨으로써 선택적으로 발현되지 않는다. 적혈구에서 단백질의 98% 이상이 글로빈으로 구성되어 있 고, 누에에서 명주 단배질인 fi bro i n 을 엄청나게 생산해낼 수 있는 원인은 이들 단백질에 대한 유전자가 특별히 증폭되기 때문이 아니고 선택적으로 발현되기 때문이다. 세포분화의 방향성이 유전자 손실이 나 유전자 , 변경이 일어나기만 하면 크게 영향받는 것은 확실하나 유 전자의 손실과 변경은 분화의 결과를 설명하는 데 있어서 아직까지 지나치게 국부적인 현상이기 때문에 일반화된 조절기구로 받아들이기 는 어렵다. 오히려 다양한 세포분화의 방향성을 설명해 주는 공통적 인 기구는 물론 완벽한 것은 아니나 선택적인 유전자 발현을 동해서 그 방향이 정해진다. 물론 선택적인 유전자 발현 그 자체는 세포분화 의 원인이 아니고 결과이다. 따라서 세포분화 기구의 핵심적인 문제 점은 〈특정된 세포에서의 유전자 발현을 선택적으로 유발시키는 원인 이 무엇인가?〉에 귀결된다. 아칙까지 결정요인의 정체를 파악하지 못한 실정이기 때문에 결정요인과 선택적 유전자 발현의 요인이 구체 적으로 어떻게 연관되는지 알 수 없으나, 개념적으로는 결정요인의 작용에 의해 유전자가 선택적으로 발현되는 것으로 인식되고 있다. (1) 세포질 요인 (cy top l a smi c fac to r ) 핵 속에서 일어나고 있는 생리적인 활동이 핵을 둘러싸고 있는 환 경요인 죽 세포질에 의해서 좌우된다는 생각이 오래 전부터 있었다.

단순히 세포질을 바꾸어 중으로써 핵의 형태적 및 생화학적 변화를 관찰하고 아마도 유전자 발현을 조절하는 요인이 세포질 속에 있을 것이라고 추측하였다. 세포질의 조성은 핵과 세포질간의 상호작용에 의해서나 혹은 세포간 상호작용에 의해서 변화받을 수 있고, 변화받 은 세포질 요인은 핵과 상관하여 핵내의 활동을 조절할 것이라고 생 각되었다. 세포질요인이 핵내의 활동에 크게 영향을 준다는 사실이 크게 두 가지 방법 즉 핵 이식과 세포융합 (cell fu s i on) 에 의해서 확인 되었다. 우선 핵 이식 실험을 위하여 Xenop us 의 포배세포의 핵을 난모세포 에 이식하였다. 난모세포의 특칭은 핵의 크기가 크고 RNA 를 다량 합성하는 것이고 포배세포의 특칭은 세포분열을 계속하고 있는 세포 이기 때문에 핵의 크기는 작고 RNA 의 합성은 거의 일어나지 않는 것이다. 그런데 포배세포의 핵을 난모세포에 이식하면 핵의 크기가 커지고 RNA 합성이 급격히 증가하며, 인이 새로 나타나고 염색질이 분산된다. 즉 포배세포의 핵이 난모세포의 핵과 유사해진다. RNA 합성이 난모세포에 이식한 포배의 핵에서 급격히 증가하는 현 상을 자기방사법을 이용하여 알아낼 수 있었다. 핵을 이식한 난모세 포에 3H-ur i d i ne 과 같은 방사능 RNA 전구물질을 주어 RNA 합성 에 참여시킨 다음 난모세포를 슬라이드 . 위에 고정시키고 그 위에 사진 에멀죤을 입혀 RNA 에 침투한 3H- uri d i n~ 료부터 방사되는 방사능 울 에멀죤에 감광시킨다. 감광된 입자 즉 은입자 (s il ver gra i ns) 의 위 치와 양을 확인함으로써 RNA 합성부위 및 대략적인 양적 차이룰 알 아낼 수 있다. 난모세포에 이식한 포배세포의 핵에서 RNA 합성이 급 격히 증가하는 반면에 난모세포의 핵과 같이 DNA 합성은 억제된다. 3H- t h yrni d i ne 으로 표지한 후 자기 방사법 으로 조사해 보면 3H -thyrnidi ne 이 난모세포의 DNA 합성에 전혀 참여하지 않음을 볼 수 있었다. Xenop us 의 콩팥세 포의 핵 을 Pleurodeles wal tii의 난모세 포에 이 식

하여 주고 난모세포에서 합성되는 단백질을 조사해 보면 Xeno p us 단 백질의 합성을 찾아볼 수 있는데, 이것은 Pleurodeles 의 세포질에 의 해 Xenop us 의 콩팥세포의 핵 이 활성화된 것이 다. 더구나 단백 질은 콩팥세포에서 합성되는 것이 아니고 Xenop us 난모세포에서 합성되는 종류와 흡사하였다. 콩팥세포에서 억압되었던 유전자가 새로운 세포 질 환경인 난모세포질내에서 새롭게 활성화된 것이다. 세포융합법에 의해서도 세포질 요인에 의하여 RNA 및 DNA 합성 이 조절되는 현상을 찾아볼 수 있었다. 일단 융합이 일어나면 서로 다른 두종류의 핵이 한 세포 속에 들어 있을 뿐만 아니라 두 종류의 세포질이 합쳐진 새로운 세포질 환경이 이루어진다. 이러한 상황에서 는 융합 이전 각각의 세포질에서 일어나던 것과는 다른 새로운 변화 가 핵에 일어난다. 사람의 조직 배양 세포인 HeLa 세포와 닭의 적혈 구를 융합해 주면 적혈구의 핵에 큰 변화가 일어난다 (Harr i s, 1967, 1968). 적혈구에 센다이 바이러스몰 처리하면 적혈구의 원형질 막이 터져서 세포질이 밖으로 유출된다. 따라서 융합세포의 세포질은 거의 HeLa 세포의 것이 다. HeLa 세포는 DNA 와 RNA 합성 이 대 단히 활발 한 세포로서 핵의 크기가 크다. 반면에 적혈구의 핵은 작고 DNA 와 RNA 합성률은 대단히 낮다. 적혈구의 핵이 융합에 의해 HeLa 세포 의 세포질에 들어가게 되는 셈인데, 융합후 적혈구의 핵은 커지고 염 색질이 분산되며 RNA 와 DNA 의 합성률이 높아진다. 또 하나의 다른 예로서는 쥐 의 간 종양세 포 (live r tum or cell) 와 생 쥐 의 섬 유아세 포 (織維茅細胞 fibr oblast) 의 융합의 경 우이 다 (Pete r son and Weis s , 1972 ; Brown and Weis s , 1975). 바이스 (We i ss) 는 이 융합세 포가 쥐의 간세포에서 특별히 합성되는 쥐의 albumi n, aldolase, tyros in e ami no tr ans fe rase(TAT) 뿐만 아니라 섬유아세포에서는 전혀 합성 되 지 않는 생 쥐 의 albu min, aldolase 및 tyros in e am ino tr a ns- fe rase 가 합성됨을 발견했다. 이것은 섬유아세포내에서 쓰이지 않았 던 유전자들이 새로운 세포질 환경에서 발현된 것으로 풀이되었다.

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그림 5-13 HeLa 세포와 적혈구를 세포 융합하여 얻은 hete r okary o n. 세포 융 합 직후에는 적혈구 핵의 크기에 큰 변화가 없으나 (A) 시간이 지남에 따라 접차 커진다 (B, C). 세포 융합 이후 적혈구 핵에서의 RNA 합성을 3H ur i d i ne 으로 표지하여 자;「방사법으로 확인하였다 (D) (Harr is, 1967, 1968)

비록 세포의 종류는 다르나 특정된 세포에서 발현되는 유전자가 다 론 세포의 핵 속에도 불활성화된 상태로 숨어 있다. 바아넷 (Barne tt, 1980) 은 이와 같은 사실을 실험적으로 보여주었다. 바아넷은 초파리 의 지 방체세포(fat body cell) 로부터 얻은 난황단백 질의 mRNA 에 대 한 cDNA 를 준비하여 in s itu재결합법으로 침샘세포의 염색체와 결합 시킴으로써 지방체세포에서만 발현되는 난황단백질 유전자가 비록 침

샘세포에서는 발현되지 않을지라도 존재하고 있다는 사실을 알아냈 다. 즉 지방체세포에서는 세포질 요인에 의해 난황단백질 유전자가 발현되며, 침샘 세포에서는 지방체세포가 가지는 세포질 요인이 결여 되어 있기 때문에 난황단백질 유전자의 발현이 억제된다. (2) 염색질의 구조적 변화 DNA 가 전사되기 위해서는 우선 염색질에 구조적인 변화가 일어나 야 된다고 생각되고 있다. 예를 들어 RNA pol ym e rase 분자가 크기 가 거의 같은 누클레오솜울 감고 있는 DNA 를 따라 이동한다는 것은 염색질에 구조적인 변화없이는 불가능하다. 또한 DNA 의 이중나선이 전사될 나선과 전사되지 않을 나선으로 분리되어야 하는데, 이와 같 은 이중나선의 분리도 누클레오솜의 구조적 변화에 의해서 아루어지 는 것으로 생각되고 있다. 누클레오솜의 변화에는 두 가지가 알려져 있는대, 누클레오솜의 수적인 변화와 비히스톤 단백질에 의한 구조적 인 변화이다. 수적인 변화는 전사될 부위의 염색질에 누쿨레오솜이 없어지는 것 인대, 이러한 염색질 부위는 RNA 중합효소 (RNA p ol y merase) 에 대 한 친화성이 높기 때문에 전사활동이 활발해진다. Oncop elt u s fa sc iat us 라는 곤충에서 rRNA 유전자를 가진 게놈 부위는 누클레오솜 울 거의 가지고 있지 않은 것으로 관찰되었는데, 이 부위의 DNA 만 이 활발하게 전사된다. Oncop e lt us 의 게놈에서 이 부위 의 에는 누클 레오솜이 결핍된 부위가 없는 점으로 보아서 이 동물에서의 rRNA 유전자에게만 특이하게 일어나는 것으로 생각되었다 (Foe et a l., 1976). Oncop e ltu s 이의의 다른 종류의 생물에서도 이와 같이 특이한 현상이 보이기는 했으나 (Labha rt and Koller, 1982} 이것은 보편적으로 일어나 는 현상이 아니다. 오히려 대부분의 경우는 rRNA 유전자가 누클레오 솜과 결합되어 있을지라도 전사가 가능하다. 또한 적혈구의 글로빈

그립 5-14 Xen o p ztS 게놈의 활성 부위와 불활성 부위. 염색질을 분리하여 RNAse 로 처리한 다음 전자현미경 관찰을 위하여 조작하였다. 염색질의 두 가지 특 징적인 부위가 관찰되었다. 그립의 오른쪽 P 라고 표지한 부위의 염 색질에는 RNA 중합효 소 라고 생각되는 분자의 크기가 큰 단백질이 있는 활 성부위와 왼쪽 N 이라고 표 지 한 부위의 염색질에는 중합효소는 보이지 않고 다만 누클레오솜만이 있는 불 활성부위가 있다 (Labha rt and Koller, 1982).

유전자와 같은 유일성 유전자도 누클레오솜이 부착되어 있는데도 불 구하고 전사되는 것으로 보아 누클레오솜이 없어져야 하는 것이 전사 에 꼭 필요한 조건은 아니다. 누클레오솜이 부착된 상태로 전사가 일어나는 부위는 반드시 다른 누클레오솜과는 다르게 누클레오솜에 변화가 일어나는 것으로 생각되 었다. 즉 특정된 비히스몬 단백질이 특정된 유전자에 부착되어 있는 누클레오솜과 결합하여 유전자와의 부착에 변화를 줄 것이라고 생각 되었다. 이러한 예측에 대한 실험적 증거는 대개 세포 종류에 따라 다르게 나타나는 특정 유전자에 대한 DNAse 의 민감도 (DNAse sens iti v ity)를 측정함으로써 알게 되었다. 전사하고 있는 유전자 부위 만 DNAse 에 의해 쉽게 붕괴되고 다른 부위의 DNA 는 히스톤에 가 려져서 효소에 의해 붕괴되지 않는다는 전제하에 우선 조직으로부터 새롭게 얻은 염색질을 낮은 농도의 DNAse I 으로 처 리한다. 효소로 처리된 염색질로부터 단백질을 제거시키고 DNA 를 추출하여 방사능

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그림 5-15 염색질에 대한 DNAse I 의 민감도 를 측 정하 는 실험고안

으로 표지한 cDNA 와 재결합시킨다. 만약 전사한 부위의 DNA 가 DNAse I 에 민감하여 붕괴되었으면 방사능 cDNA 와의 재결합은 일 어나지 않을 것이다. 따라서 DNAse 민감도를 측정함으로써 비록 누 클레오솜이 부착되어 있다고 할지라도 활성화된 DNA 부위에서는 RNA p ol ym erase 와 같은 효소를 부착시 킬 수 있을 만큼 누클레오솜 에 변화가 일어났다고 짐작할 수 있었다. 와인트라우브 (We intr aub) 와 그라우딘 (Grou di ne, 1976) 은 닭의 적혈 구의 염색질을 DNAse I 으로 처리한 다음 DNA 를 추출하여 방사능 글로빈 cDNA 와 재결합시켰다. 사실상 DNAse I 으로 처리받은 DNA 는 방사능 글로빈 cDNA 와 거의 재결합하지 않았다. 물론 DNAse ~로 처 리받지 않은 적 혈구 DNA 나 혹은 DNAse I 으로 처 리받은 뇌세포 및 섬유아세포의 DNA 는 글로빈 cDNA 와 결합하였 다. 죽 섭유아세포와 뇌세포의 글로빈 DNA 는 전사되고 있지 않았기 때문에 DNAse I 에 의해 제거되지 않았다. 같은 방법으로 수란관세포의 염색질에서 활발하게 전사되는 난알부

표 5-1 DNAse I 으로 처리한 DNA 와의 cDNA 결합

민유전자의 DNA 를 DNAse I 으로 제거시킬 수 있었다. 그러나 적혈 구에 내재 하는 난알부민유전자는 DNAse I 에 의해 분해 되 지 않았다 . 즉 난알부민 cDNA 는 적혈구 DNA 에는 재결합되었으나, 수란관 염 색질로부터 추출한 DNA 에는 재결합되지 않았다. (3) 비히 스 톤 단백질 핵 속에는 히스톤단백질 이의에 비히스톤단백질 (no nhi s t one pro te i n s ) 이 있는데 , 비 히스몬 단백 질은 영 색 질의 구조 변화에 영 향을 주어 선택적 유전자 발현에 관여하는 것 으 로 생각되고 있다 . 즉 적혈 구에는 크게 나누어 비히스톤 단백질에 HMG(hig h mobil ity grou p ) -14 와 HM G - 17 의 두 종류가 있는데, 이들 HMG 단백질의 존재 여 부 에 따라 글로빈 유전자의 발현이 결정된다. 염색질을 o.35M Na Cl 로 처리하면 분자량이 낮은 단백질들이 추출되는데, 이와 같은 방법으로 비히스몬 단백질을 제거시키고, DNAse I 에 대한 민감도를 조사해

20181614 • HMG 단백질을

그림 5-16 글로빈유전자에 대한 DNAse I 의 민감도. 닭의 적혈구 염색질에서 HMG 단백질을 제거시킨 다음, 둘로 나누어 한쪽에는 HMG 단백질을 다시 넣어 주고, 다른 한쪽에는 HMG 단백질을 넣어 주지 않았다. 이와 같이 처 리한 두 부류의 DNA 와 HM G-를 처음부터 추출하지 않은 적혈구 염색질에 각각 DNAsel 를 작용시킨 다음 방사능 동위 원소를 표지 한 cDNA 와 재 결합 시켰다 (We i sbrod and Wein t r au b, 1979).

봄으로써 비히스톤 단백질의 존재와 선택적인 유전자 발현과의 관계 를 침작할 수 있었다. HMG 단백질을 적혈구 염색질로부터 제거시키 면 글로빈유전자는 DNAse I 에 의해 분해되지 않았다. 그러나 이들 단백질을 다시 넣어 주면 글로빈유전자의 DNAse I 에 대한 민감도가 회복됨을 관찰할 수 있었다 (We i sbrod and Wein t r au b, 1979 ; Gazit et al., 19so). 그러나 뇌세포에서 추출한 HMG-14 와 HMG-17 은 적혈구 의 글로빈유전자의 DNAse I 에 대한 민감도를 회복시킬 수 있었으 나, 적혈구의 HMG 단백질로서는 뇌세포 유전자의 DNAse I 에 대한 민감도를 회복시키지 못했다. 이 두 종류의 비히스톤 단백질이 여러

종류의 조직에서 유전자 발현을 유발시키는 데 필요한 것이지만, 세 포의 종류에 따라서는 이들 단백질만 가지고는 선택적 유전자 발현의 유발이 어려웠다. (4) 호르몬 비히스본 단백질 이의에도 호르몬이 유전자 발현을 조철하는 요인 으로 알려져 있다. 지금까지 가장 잘 연구된 호르몬은 엑디존과 에스 테로겐아다. 초파리 침샘세포에서의 부풀림이 엑디존에 의해서 조절 되는 예와 닭의 수란관에서 다량 합성되는 난알부민의 유전자 발현이 에스테로겐에 의해서 조철되는 예가 그러한 경우이다. 1) 엑디존에 의한 부풀림 양상의 변화 초파리 발생중 용화기에 나타나는 부풀림 양상의 변화는 엑디존의 분비 시기와 일치할 뿐만 아니라 엑디존의 분비 없이는 용화가 일어 나지 않는다. 베커 (Becker, 1959) 는 이러한 사실에 근거하여 부풀림 형성이 엑디존에 의해 조절된다고 가정하였다. 엑디존은 전홍선 (pro th o raci c gla nd) 에서 분비 되는 호르몬이 다. 초파리 유충의 중간을 가는 끈으로 매어서 전홍선에서 분비되는 엑디존이 유충 뒷부분으로 의 이동을 제한하고 앞부분으로의 이동만을 허락하였다. 그리고 유충 의 앞부분과 뒷부분의 세포내 염색체를 관찰하였는데, 앞부분에서만 정상적인 발생단계 특유의 부풀림 형성이 가능했을 뿐 뒷부분에서는 매듭(lig a ti on) 짓기 전과 동일한 양상의 부풀림을 보였다. 죽 부풀림 의 형성은 엑디존에 의해 조절됨을 보여주었다. 또한 침샘을 다른 개 체로 이식하면 숙주의 것과 동일한 부풀림 양상이 이식 세포에서도 나타남으로 보아 엑디존은 부풀림을 조절하는 호르몬임을 확인할 수 있었다. 엑디존의 역할에 대해 좀더 직접적인 증거는 in vitr o 실험에서 얻

협'•같,r , i '•따. . mI꿉1: , DA -- \ : ` . `-1• ~,녔 :； -I 책\ 유 1rC; ' f ．, ?꾸 .이 . ^ .` . .4나,I : ,. .! . Y oloJFKF량f i 74EF 758

그림 5-17 D. melanog as te r 의 배양된 침샘 세포에서 엑디존으로 유도된 부풀 림. (A) 부풀림의 순서가 엑디존에 의해 유도된다. (i) 엑디존을 처리하 지 않음. (ii-v ) 25 분, 1 시간, 2 시간, 4 시간 동안 엑디존으로 처리된 후의 부풀림. (B) 엑디존을 처리하였을 때와 처리하지 않았을 때 743EF 와 75B 에 in situ 결합한 RNA 의 양을 은입 자의 수로 나타냄 (Bonner and Pardue, 1977J .

울 수 있었다. 엑다존을 미성숙한 유충에 직접 주사해 주면 단계 특 유의 부풀림이 나타난다 (Clever and Karlson, 1960 ; Clever, 1961). 또한 침샘을 분리하여 i n vitr o 에서 엑디존에 넣어 줄지라도 부풀림이 유 발된다. 그림 5-19 은 이와 같은 실험에서 엑디존에 의해 부풀림이 단 계에 따른 특유의 변화를 보여주고 있다. 특히 대 (band) 74EF 와 75B 에서의 부풀림의 변화는 특기할 만하다. 부풀림이 엑디존에 의해 조절될 때에는 엑디존이 염색체상 특정된 부위와 결합한다. 우선 엑디존을 인식하는 토끼의 항체를 초파리 침

75 B

그립 5-18 엑디존과 결합하는 초파리 염색체 상의 위치. 일단 염색체를 엑디 존으로 처리한 다음 엑디존에 대한 형광항체를 결합시켜 위치를 확인하였 다. (A) 침샘염색체의 위상차 현미경 사진. (B) (A) 의 염색체에 나타난 엑디존 결합부위를 확인한 형광현미경 사진.

샘에 넣어준 다음 토끼의 항체를 인식하는 형광물질이 표지된 염소의 항체를 넣어 주면, 염색체상에 엑디존이 결합되어 있는 부분에 형광 물질이 나타난다. 이와 같은 방법으로 엑디존에 의해 조절되는 부풀 림 부위가 엑디존과 결합되어 있음을 확인하였다 (Groneme y er and Pongs , 1980). 엑디존에 민감한 부풀림은 크게 3 종류 죽 엑디존에 의해 유발되는 부풀림, 엑디존에 의해 억제되는 부풀림 그리고 엑디존에 의해 처음 몇 시간만 유발되는 부풀립이 있다. 두번째 범주에 속하는 부풀림의 예로서 염색체 3 의 68C 를 들 수 있다. 이 부풀림은 번데기

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그림 5-19 초파리 염색질에 DNAseI 을 처리할 때 방출되는 단백질의 위치 결정. 그 단백질에 대한 항체를 만들어 염색체에 결합시킨 다음 , 다론 형광항체를 이용하여 그 위치를 확인하였다. (A) 위상차 현마경 사진 (B) 엑디존 결합부위 (May field et al., 1978).

껍질을 딱딱한 표면에 부착시키는 풀의 역할을 하는 단백질에 대한 유전자 Sgs 3 로서 마지막 유충 시기에 침샘세포에서 부풀어 오른다 (Korge , 1975). 침샘을 in v it ro 상태에서 배양하면서 엑디존을 넣어 주 면 곧 그 부풀림이 사라지면서 동시에 이 유전자로부터의 전사활동도 중지된다 (Me y ero witz and Rog ne ss, 19s2). 즉 이 풀 단백질은 유충을 딱딱한 표면에 부착시키기 위해 필요할 때에만 합성된다. 엑디존이 염색체상 특정 부위에 결합되는 것은 비히스톤 단백질에 의해 매개되 는 것처럼 보인다. 초파리의 염색질은 DNAse I 으로 처리하면 63KD 의 단백질이 떨어져 나오는데, 이 단백질은 제 3 유충기에 엑디존에 민 감한 염색체 부위에 결합하여 유전자의 특칭적인 염색질의 구조를 유 지 시 키 는 데 도움을 준다 (May field eta !., 1978) . 2) 에스테로겐에 의한 난알부민유전자 발현의 조절 닭은 난소에서 난자가 배란되면 수란관의 앞부분에 해당하는 누두 (漏斗, infundibu lum) 에서 수정 된 후 수란관을 따라 내 려 가면서 여 러

종류의 껍질이 수란관으로 분비되어 난자를 둘러싸게 된다. 그 중 흰 자위의 주성분인 난알부민 난자가 통과하는 시기에 수란관 세포에서 전체 단백질의 50% 이상이 합성 분비되는데 이와 같이 시기에 맞추 어 이루어지는 난알부민의 합성은 에스테로겐에 의해 촉진된다. 즉 아직 성숙하지 못한 암닭에 에스데로겐을 주사해 주면 수란관 세포에 서 난알부민의 합성이 급격히 증가되는 것을 관찰할 수 있었다

1 차자 국 자극중지 2 차자극

그립 5-20 4 일된 병아리 수란관에서의 난알부민합성에 미치는 에스테로겐의 영향. 처음 10 일 동안 매일 병아리에게 에스데로겐을 주사하였다 (l 차 자 국) . 2 주 동안 주사하지 않다가 다시 주사하였다 (2 차 자극) (Palm iter and Schim ke, 1973) .

(Palm iter and Schim ke, 1973). 에스데로겐울 주사한 후 18 시간만에 난 알부민의 합성이 관찰되기 시작하였고 그 후 에스데로겐을 계속 처리 하는 동안 난알부민의 양이 급격하게 상승하여 새로 합성되는 단백질 의 거의 대부분을 충당하였다. 그러나 에스테로겐 처리를 중단하면

난알부민의 합성이 급격히 감소하는데 만약 에스데로겐을 다시 공급 해 주면 단백질 합성이 회복된다. 이와 같은 실험결과로 보아 난알부 민의 합성은 에스데로겐에 의해 조절된다고 할 수 있다. 그런데 에스 데로겐의 효과는 a-aman iti n 이나 acti no my ci n D 에 의해서 저지되는 점으로 보아서 에스데로겐이 난알부민유전자의 전사에 관여한다는 점 울 알게 되 었다 (O'Malle y and Means, 1974 ; E-delman, 1975) . 즉 에스 데로겐에 의한 난알부민유전자의 선택적 발현으로 난알부민 mRNA 의 합성이 촉진된다. 이러한 결론은 난알부민 mRNA 에 대한 cDNA 와 수란관세포에서 추출한 난알부민 mRNA 와의 재결합 실험을 통해 mRNA 분자의 수 롤 알아냄으로써 확인할 수 있었다. 우선 수란관 세포의 세포질로부 터 전체 RNA 를 추출하여 olig o -d e ox:i1 :h ym i di n e (olig o -dT)-cellulose bead 를 통과시킨다. mRNA 중 p ol y (A) 가 3 ' 말단에 꼬리처럼 부착 되 어 있는 pol y (A) mRNA 는 pol y (A) 와 ol ig o-dT 간의 결 합으로 인 해 ol ig o-dT 에 붙잡히고, 나머 지 RNA 는 통과한다. 고 농도의 영 류 용액을 사용하여 ol ig o-dT 로부터 pol y (A ) mRNA 를 회수하고 전기 영동을 이용하여 종류별로 분리한 다음 전기영동대에서 개별적으로 mRNA 를 추출한다. 각각의 pol y (A) mRNA 를 in v it ro 에 서 해 독시 키고 다시 전기영동하여 어느 전기영동대에서 추출한 pol y (A ) rnRNA 가 난알부민 mRNA 인지를 확인할 수 있었다. 이와 같이 준 비 된 rnRNA 로부터 역 전사효소 (reverse tra nsrp ipa ta s e) 를 사용하여 cDNA 를 만든 다음, cDNA 와 수란관 세포로부터 추출한 난알부민 rnRNA 를 재결합시켜 봄으로써 mRNA 의 분자수를 산출할 수 있었 다. 이러한 실험을 통해서 에스데로겐 처리 여부에 따라 난알부민 rnRNA 분자가 급격하게 변한다는 사실을 관찰할 수 있었다. 즉 에 스테로겐을 처리하기 전에는 mRNA 분자수가 수란관의 상피세포당 30 분자에 지나지 않았으나 (Moen and Palm iter , 1980), 에스테로겐을 주사한 18 일 후에는 50,000 분자로 증가하였다 (O'Malle y et al., 1975) .

수]란관 세포T 亨g三 ~줄dm T：- d公T dT三〈 dT

그림 5-21 수란관 세포로부터의 난알부민 mRNA 추출 및 cDNA 제조법.

또한 에스테로겐의 처리를 중단하면 난알부민 mRNA 분자수는 60 에 지나지 않았다 (Mck nig h t et al., 1975). 해리스 (H arri s, 1975) 등과 루프 (Roop, 1978) 등도 이와 유사한 결과를 얻었다(표 5-2). 특히 루프의

표 5-2 전사수준에서 난알부민유전자 발현의 조건

A 의 출처 : Harris e t al. (1 975). B의 출처 : Roop et al. (1 978). a. 10 일된 White Leg h orn 병아리에 die th yls ti lbe str ol (D E S, 일종의 합성 에스트 로겐) 2.5m g을 주사한 다음 정해전 시간에 따라 희생시켰다. 에스트로겐의 2 차 처리 실험을 위해서는 병아리를 먼저 2 . 5m g의 DES 로 10 일 동안 처리한 다음, 11 일 동안 처리중지하였다가 12 일째 되는 날에 한 번의 2.5mg DES 를 주사하고 정해진 시간에 희생시켰다. b. 난알부민 mRNA 에 대한 3H-cDNA 를 지시한 대로 호르몬 처리를 받은 병아 리의 수란관 RNA 와 결합시켰다• c. 난알부민 cDNA 와의 재결합실험으로 결정하였다.

실험에서는 에스트로겐에 의해 난알부민 cDNA 와 재결합할 수 있는 핵 RNA 가 합성됨을 보여주었다. 이러한 실험 결과를 종합해 볼 때 수란관 세포에서의 난알부민 합성은 에스테로겐에 의해 조철되는 것 임을 알수 있었다.

에스데로겐에 의해 난알부민 mRNA 의 합성이 촉진되는 사실은 in situ 재결합에 의해서도 확인되었다. 즉 에스테로겐으로 처리된 수란 관 세포에서는 방사능물질로 표지된 cDNA 와 결합하는 난알부민 mRNA 가 다량 나타났고, 에스테로겐 처리를 중단한 세포에서는 은 입자가 거의 보이지 않았다. 그러나 프로게스테론으로 다시 촉진시켰 울 경우 mRNA 은입자가 보이기 시작했다 (She p herd et a l., 1980}. 아직까지 에스데로겐이 어떻게 수란관 세포에서만 난알부민 mRNA 합성을 촉진시키는지에 대해서는 확실히 알 수 없다. 아마도 에 스 테로겐과 수용분자 간의 복합체가 염색질과 결합함으로써 선택적 인 유 전 자 발현이 유발될 것 이라고 생각되고 있을 뿐이다. 특별히 수

l

그림 5-22 난알부민 cDNA 와의 in situ 재결합법으로 알아낸 난알부민 mRNA 의 위치. (A) 수란관 세포 (TG) 에는 에스테로겐 처리 후 강하게 표지됨. 비 수란관 세포 (N) 는 표지되지 않음. (B) 에스데로겐을 제거시키면 거의 표지되지 않음. (C) 프로게스테론을 다시 처리해 주면 수란관 세포에 표지 2가µ. m많( S이h ep나 h타e 남rd. e t 두a l. , 개 1의98 0)확. 인되지 않은 세포 (U) 도 관찰됨. 눈금의 길이는

란관세포에서만 난알부민유전자가 발현되는 이유는 표적세포의 특이 성 때문이라고 생각되고 있다. 즉 표적세포의 세포질에 있는 수용분 자의 특이성 때문에 에스데로겐이 수란관세포에만 선택적으로 수용될 수 있다. 일반적으로 스데로이드 계통의 호르몬이 핵 속으로 들어가 서 염색질에 결합하기까지는 두 단계의 반응이 일어나는 것으로 생각 되고 있다. 첫 단계에는 호르몬의 표적세포로의 두과이다. 스데로이 드계의 호르몬은 표적세포와 비표적세포에 모두 확산해서 들어가지 만, 비표적세포에서는 수용분자가 없기 때문에 호르몬이 세포내에 보 존되지 못하고 표적세포에서는 수용분자가 있기 때문에 보 존 된다. 단 백질로 생각되는 수용분자와 호르몬간의 결합으로 세포질에서 복합체 가 형성된다. 두번째 단계로는 핵 속으로 복합체가 이동하여 염색질 과 결합한다. (5) 글로빈유전자의 전사 유전자 발현이 전사수준에서 조절되는 예로서 가장 잘 연구된 경우 는 발생단계에 따른 글로빈유전자의 순차적 활성화에서 찾아볼 수 있 다. 닭이나 사람의 경우 헤모글로빈 합성은 발생과정에 따라 변한다. 닭에서는 계배의 암구 (area opa c a) 후부에 자리하고 있는 혈도 (blood i slands) 에서 헤모글로빈이 만들어지는데, 20 내지 23 시간 경과한 계 배에서는 아직 글로빈유전자가 전사되지 않지만, 약 35 시간이 경과하 면 두 차례의 세포분열을 더 하게 되는데, 이때부터 이들 적아구(赤 茅球 e rythr oblas t)에서 헤모글로반이 상당히 빠른 속도로 합성된다. 죽 발생 35 시간만에 글로빈유전자가 처음으로 활성화된다. 점차 발생이 진행됨에 따라 글로빈유전자의 전사는 또 다른 형태로 조절된다. 닭과 사람을 포함하여 여러 종류의 동물에서는 발생배 혹 은 태아의 헤모글로빈이 성체의 적혈구 헤모글로빈과 다르다. 사람의 발생배 헤모글로빈은 두 분자의 제타 (ze ta, t) 글로빈과 두 분자의 입

염」제:’ : | :` ;\ a2 y 2 미성숙:아

그림 5-23 발 생에 따른 글로빈유전자의 순차적 활성화

실론 (e p s il on , E) 글로빈 및 석손자의 행으로 구성되어 있다. 그러나 임 신 2 개월 정도 지나면 t와 c 글로빈의 합성은 갑자기 중지되고, 그 대신 알파 (al p ha, a) 와 감마(g amma, r) 글로빈의 합성이 증가한다. 두 분자의 y글로빈과 두 분자의 云군로반이 결합하여 한 분자의 태아 헤 모글로빈을 이루게 된다. 임신 3 개월부터 베타 (be t a, f3)글로빈과 델타 (delta , o) 글로빈유전자가 활성화되면서 r 글로빈유전자의 발현은 중 지된다. 분만 후에는 더 빠른 속도로 태아의 헤모글로빈이 성체의 헤 모글로빈의 형태로 바뀐다. 즉, 정상적으로 성체의 헤모글로빈은 97% 가 a2/J 2, 2~3% 가 a282 그리고 l% 가 a2 Y2 로 구성되어 있다. 사람에서는 t와 a 글로빈유전자는 16 번의 염색체에 자리하고 있고, €, r, 8 및 8 글로빈유전자는 11 번의 염색체에 순서대로 자리하고 있 다. 이러한 점으로 보아 11 번의 염색체에 있는 이들 글로빈유전자들 이 발생배에서 태아의 글로빈 형태로 그리고 태아에서 성체의 글로빈 형태로 순서에 따라 발현되는 데에는 반드시 이러한 발현 순서를 조

적혈 구 난형,呼 위 간 지`라

그림 5-24 발생 에 따른 글로빈유전자와 순차적 활성 화

절하는 특별한 기구가 있을 것으로 생각되고 있다. 그러나 아직 이러 한 기구는 모른다. 모든 면에 있어서 정상적이지만, 태아의 헤모글로 빈 합성만은 비정상적으로 성체에서까지도 중지하지 않고 계속하는 개체에서 유전자 발현 조절기구와 관련되는 단서를 얻을 수 있었다. 즉 동일한 계보의 세포에서 태아의 글로빈으로부터 성체의 글로빈으 로 전환하는 것이 적아구에 선천적으로 주어진 기구에 기인할 것이라 는 단서가 최근 관찰되었다. 사람의 발생배의 난황낭(y olk sac) 으로 부터 적혈구의 전구 세포를 분리하여 배양해 보면 그 중에는 발생배 의 헤모글로빈을 합성 하는 세포들과 함께 간 세포 (s t em cells) 가 나타 난다. 이들 간 세포들은 후에 태아의 글로빈 그리고 성체의 글로빈을 합성하는 적혈구가 된다 (S ta ma t o y anno p oulos et al., 1987). 사람의 태 아 적아구와 생쥐의 적아구 종양세포를 융합하면 처음에는 사람의 태 아 헤모글로빈이 융합세포에서 만들어진다. 그러나, 이들 융합세포가 계속 세포분열하면 나중에는 성체의 글로빈 단백질을 합성한다. 대개 15-20 주의 사람의 태아 적아구를 사용하여 이와 갇은 조작을 하면, 8 -10 주의 태아를 가지고 하는 것보다 글로빈 형태의 전이과정이 더 빠

르게 나타남을 관찰할 수 있다. 이러한 관찰로부터 그 세포에 선천적 으로 내재하고 있는 시계와 같은 기구가 있을 것이라는 생각이 가능 하였다 (Pa p a y anno p oulou et a l., 1986). (6) 전사조절 단백질 유전자가 전사될 때 조절 단백질의 개입으로 인하여 그 전사가 조 절될 수 있다는 가능성이 5S rRNA 유전자의 전사과정에서 관찰되었 다. 즉 5S rRNA 유전자는 발생과정중 전사수준에서 조절된다 (Xom, 1982). 반 배수체의 게놈 속에는 20,000 개의 난모세포형의 5S 유전자 와 400 개의 체세포형 5S 유전자가 있는데, 난자형성 초기에는 이들 유전자 모두가 전사된다. 그러나 난자형성 후기에 모든 5S 유전자의 발현은 중지되고 포배 전이 시기까지 다시 발현되지 않는다. 포배기 에 다시 난모세포형과 체세포형의 5S 유전자가 발현되지만 포배기가 끝날 무렵 체세포형의 5S 유전자만이 발현된다. 5S 유전자의 발현을 조절하는 RNA 중합효소는 RNA 중합효소 l11 인데 이 효소는 특이한 p romo t er 에만 결합한다. 죽 RNA 중합효소 l 과 Il 의 p romo t er 는 유전자의 5' 쪽의 가장자리 에 자리 하고 있지 만, RNA 중합효소 Ill 에 대한 p romo t er 는 유전자의 가운데 에 자리 하고 있다. 이러한 사실은 Xen op us 의 5S rRNA 유전자를 부분적으 로 결손시킨 다음 그 유전자가 아직도 전사능력을 유지하는지롤 살펴 봄으로써 알아낼 수 있었다. 즉, 5S 유전자의 5' 쪽의 가장자리나 혹 은 3' 쪽의 가장자리를 효소로 제거시킨 다음 RNA 중합효소 l11 을 넣 고 전사시켜 보면, 5S 유전자의 전사는 정확하게 일어난다. 그러나 5S rRNA 유전자의 가운데 부위에 해당하는 누클레오티드 번호 50 에 서 83 의 누클레오티드를 제거시킨 다음, 전사시켜 보면 5S rRNA 유 전자는 전혀 전사되지 않는다 (Sakon j u et a l., 1 980 ; Bog en hage n et a l., 1980). 더구나 RNA 중합효소 Ill 에 의해 전사되는 유전자내에는 보

결손부위

그림 5-25 Xenopu s laevis 5S rRNA 유전자에 대한 결손지도. 5S rRNA 유전자 를 프라스미드에 조합시켜 증폭시킨 다음 시험관내에서 전사능력을 측 정하 였다. 이때 5S rRNA 유전자를 상위에서부터 그림에 표시한 선에 해당하는 부위만큼씩 결손시키면서 전사능력을 측정함으로써, 5S rRNA 유전자의 위 치를 확인할 수 있었다. 특별히 하위 50~83 염기쌍을 결손시키면 , 유전자는 전사능력을 상실한다. ＋는 전사능력 있음을 그리고 -는 전사능력이 없음 을 나타낸다 (Brown, 19s1).

존적인 부위가 있는 것으로 관찰되고 있다. 죽 AGCAGGGT 와 갇은 염기배열이 Xenoj)u s 5S rRNA 유전자의 영기서열번호 55 와 62 사이 에서 관찰되었고 유사한 염기서열이 누에 (Bomb yx mo ri)의 tyros in e t RNA 와 adenov iru s VA-1 유전자에서도 관찰되었다. 박테리아의 RNA 중합효소는 DNA 에 직접 결합되지만, 진핵세포 의 RNA 중합효소는 p romo t er 에 직접 결합되지 않고 특별한 단백질 에 의해 중개 된다. 죽, Xen oj)us의 5Sr RNA 유전자에 RNA 중합효 소 따울 인위적으로 첨가해 줄지라도, 정확한 전사는 일어나지 않는

다. 그러나 5S rRNA 유전자에 핵 추출물을 함께 넣어주면 전사가 정확하게 일어난다. 이때 5S rRNA 유전자 조절부위에 특별히 결합 하는 38,5KD 의 단백질이 있는데, RNA 중합효소 IIl 을 p romo t er 에 결합시키는 역할을 하는 것으로 보인다 (N g et a l., 1979 ; Eng el ke et al., 1980). 이 단백질이 없으면 sSrRNA 유전자의 전사도 일어나지 않는 다. 이 단백질은 TFIIIA 라고 불리는데, 5S rRNA 유전자에만 특이하 게 작용하는 전사 조절 단백질로서 발생중에 단계에 따라 작용된다. 즉 sS rRNA 가 다량 합성되는 난자형성 초기에는 TFIIIA 단백질은 다량 존재하나, 5S rRNA 합성은 난자형성 말기에는 대단히 낮은 수 준으로 떨어진다 (G i nsber g et a l., 1984). 5S rRNA 유전자 발현은 핵 속에 존재하는 TFIIIA 의 양과 관계되 는 것으로 보인다. 즉 유전자 재조합법으로 클로운된 난모세포형 및 체세포형 5S rRNA 유전자를 난모세포와 포배세포의 핵 속으로 주입 시키면 TFIIIA 는 난모세포형에 대해서보다도 체세포형에 대해서 약 200 배나 더 높은 친화력을 가지고 있는 것을 알 수 있다. 따라서 TF IIIA 의 농도가 낮을 때에는 체세포형의 유전자에만 결합하지만 농도 가 높을 때에는 체세포형은 물론 난모세포형의 5S rRNA 유전자도 TFIIIA 의 결합에 의해 활성화된다. 체세포형 5S rRNA 유전자만이 활성화되어 있는 후기 포배세포의 핵 속으로 순수한 TFIIIA 를 다량 주입하면 난모세포형의 유전자도 함께 활성화된다. 5S rRNA 유전자내의 TFIIIA 결합부위를 돌연변이 분석, DNAseI foo tp ri n t i ng , gua nosin e meth yla ti on 및 pho sph a te blockage 등과 갇은 방법 으로 알아내 었 다 (Sakon j u and Brown, 1982 ; Pie l er et a l., 1985). 돌연변이 분석법으로 전사가 적절하게 일어나는 데 필요한 부 위 세군데 즉, 누클레오티드 배열 번호 50~61, 70~71 그리고 80 ~89 를 알아내었다. 누클레오티드 배열 번호 50~61 은 RNA 중합효 소 Ill 에 의하여 전사되는 모든 다른 유전자에서도 발견되었다. 체세 포형 sS rRNA 유전자와 난모세포형 5S rRNA 유전자는 이 결합부위

가 서로 다른데 아마도 이러한 차이 때문에 TFIIIA 에 대한 친화도도 다를 것이라고 생각되고 있다 . DNAse I fo o tp r i n ti n g도 DNA 상의 단밸질과의 결합부위를 찾아내 는 방법이다. TFIIIA 와 같은 결합 단백질을 방사능 동위원소로 표지 된 DNA 에 결합시킨 다음 별로 특이성이 없는 일반적인 DNAse 로 처리하여 전기영동법으로 분리하면 크기가 다른 여러 종류의 ol ig onucleo ti des 를 얻을 수 있다. 이 때 ol ig onucleo ti des 간의 염기

• b C

그림 5-26 5S DNA 내 TF fil A 결합부원 방사능 동위원소로 표지한 5S DNA 를 TFIIA 로 처리한 다음, DNAse 로 분해시켰다. 분해된 DNA 토막을 전기영동 하여 자기방사하였다. TF fil A의 농도를 증가시켜주면 (a-h) 전기영동띠가 없는 빈자리가 나타나는데, 이 자리에 있는 D NA 토막이 TF fil A에 보호받음으로 전 기 영동띠가 나타나지 않았다 (Sakonju and Brown, 1982) .

수의 차이는 일반적으로 한 개 정도에 지나지 않지만 , 만약 결합단백 질에 의해 DNA의 결합부위가 보호되면, DNAse 에 의해 분해되지 않기 때문에 바로 해당하는 부위의 ol ig onucleo ti des 가 전기영동판에 나타나지 않는다. 이러한 분석을 TFIIIA 단백질을 이용하여 시행하 므로써 역시 세 군데의 결합 부위가 있음을 확인할 수 있었다. 결합 부위를 알아내는 또 하나의 다른 방법은 gu anos i ne 에 메칠기 롤 첨가시키든가 혹은 인산기에 에칠기를 첨가시킴으로써 이러한 첨 가반응이 TFIIIA 결합에 어떤 영향을 주는지를 관찰하는 것이다. 배 열번호 70, 71 그리고 80~89 의 gu anos i ne 에 메칠기를 첨가하고 배열 번호 70, 71 그리고 80~87 의 인산기에 에칠기를 첨가하면 TFIIIA 결 합이 억제되기 때문에 TFIIIA 에 의한 세 군데의 DNA 부위의 보호가 불가능해진다. 5S rRNA 유전자의 p romo t er 에는 TFIIIA 에 대한 결합부위가 세 군데 있는 반면에 TFIIIA 단백질에는 9 개의 DNA 결합부위가 있다. DNA 결합부위는 주로 영기성 아미노산울 주요 아미노산으로 하는 구형 모양의 부위 이 다 (glo bular domain ) . 이들 구형 부위 는 각각 Zn 이온을 중심으로 안정되어 있고 9 개의 구형부위는 일정한 간격울 가 지고 반복된 배열을 하고 있다(t andom array) . 이러한 배열로 인하여

+40 +50 +6 0 +70 +80 +90 +100

그림 5-27 Xenopu s lae v is의 5SrRNA 유전자의 조절부위와 TFil lA 사이의 상 호작용. 회색상자 : gua nosin e 잔기가 메철화되면 TF ill A의 결합울 방해한 다. 삼각형 (T) : TF ill A 와 접촉을 가진 DNA 의 인산기 , 믿줄 : TF ill A의 결합으로 DNAse I 의 작용으로 보호받은 부위. 화살표로 지시된 염기는 난 모세포형의 5S rRNA 유전자에서는 다르다 (Sakon j a and Brown, 1982).

RNA 중합효소가 DNA 를 따라 이동할 때 DNA 를 고정시키는 역할 울 하는 것으로 생각되고 있다. 즉 TF ilI A 가 DNA 에 결합하여 이중 나선을 분리시키는 것과 갇은 sS rRNA 유전자의 구조적 변화 (con fon nati on al chang e) 를 유발하는 것으로 해석되고 있다(Kmi ec and Worcel, 1985 ; Kmiec et al., 1986) . 그러 나 이 러 한 해 석 에 반론이 제 기 된 경우도 있다 (Wol ff e et al., 1987).

(A)

그립 5-28 전사조절단백질 TFlIIA 의 구조. (A) DNA 와 TFlIIA 단백질의 상대적 배열. 9 개의 손가락과 갑은 구조가 TF 때 A 에서 나와 5S p romo t er 와 결합한다. (B) DNA 과 결합하는 손가락 과 감은 구조를 아연 (Zn) 으로 안정시키고 염기성 산기(혹색의 원)가 DNA 와 접촉을 이룬다 (M ill er et a l., 1985).

5S rRNA 의 유전자 발현이 TFllIA 단백질에 의해 조절된다는 사 실은 상당한 의미를 내포하고 있다. 아직까지 결정요인의 정체와 작 용기구에 대해서 전혀 모르고 있는 실정에서 이러한 선택적 유전자 발현의 조절 단백질에 대한 확인을 결정요인의 정체와 작용기구를 보 여주는 것처럼 받아들여질 수 있다. 물론 세포의 운명결정은 세포의 기능부여와 동일한 의미를 가지고 있으며 세포 특유의 기능부여는 단 백질의 종류에 기인한다고 할 수 있기 때문에 선택적 유전자 발현의 조절기구를 규명하는 것은 대단히 중요하다. 그러나 5S rRNA 유전 자 발현을 조절하는 TFllIA 단백질의 합성조철 죽 TFllIA 유전자의

선택적인 발현조절이 규명되어야만 궁극적으로 5S rRNA 유전자 발 현조절로 설명될 수 있다는 점을 감안할 때 세포운명결정을 위한 선 덱적 유전자 발현의 조절기구를 밝힌다는 것은 그렇게 쉬운 일이 아 니라는 점을 실감케 한다. (7) swit ch gen es swi tch g enes 이란 이 유전자의 생성물의 유무에 따라 세포의 분화 방향을 변경시키는 유전자를 의미한다. 즉 swi tch g ene 의 생성물은 두 가지 종류의 세포로 분화할 수 있는 잠재력을 가진 세포의 방향을 한쪽으로 고정시켜 준다. swi tch g ene 의 가장 좋 은 예는 환형동물 홉충류의 일종인 Caenorhabdit is e leg a ns 의 Iin- 12 유전자에 관한 것이다 (Greenwald et al., 1983). C. e leg a ns 의 야생종의 발생배에는 Zl. PPP 와 Z4. aaa 라는 두 종류의 세포가 형성되는데 두 종류의 세포 중 한 종류는 자궁 갈 고리세포 (u t er i ne anchor cell, ac) 가 되고, 다른 종류의 세포는 복면 자 궁 (ven tr al ute r i ne , vu) 의 모세포가 된다. Ii n-12 의 열성 돌연변이종에 서는 이 유전자가 전사되지 않으며, 두 종류의 세포는 모두 갈고리세

표 5-3 line -12 돌연번이 종에서의 세포 운명 결정

포로 분화한다. 그러나 우성 돌연변이종에서는 !i n ~ 12 의 전사정도가 높으며 그 결과 두 종류의 세포는 모두 복면자궁의 모세포가 된다. 이러한 관찰로부터 lin- 12 유전자는 두 가지 발생 방향 중 하나를 선 택해 주는 역할을 한다. lin - 12 유전자는 이 의에도 다른 종류의 세 포에서도 유사한 역할을 하는 것으로 관찰되었다. 죽 복측과 배측의 m(l/r)pa 세포는 각각 성 중배엽 모세포 (sex mesoblas t)와 체강세포 (coelomoc yt e) 가 되지만 우성 !in~ 12 돌연변이종은 모두 성 중배엽 모 세포가 되는 반면에 열성 돌연변이종은 모두 체강세포가 된다. 초파리 의 Notc h 유전자도 일종의 swi tch g ene 으로 알려 져 있다. 낭배기 직후 발성성배의 배측 정중선을 따라 자리하고 있는 1800 개의 의배엽 세포들은 배측 신경색 (背側神 經 索, ventr a l nerve cord) 을 형성 하는데, 이들 중 25% 가량의 세포는 신경 원세포 (neuroblas t)가 되 고, 그 나머지는 하피(下皮 hyp erde rmi s) 의 전구 세포가 된다. 즉 신

·l

그림 5-29 Notc h 돌연변이의 효과. 야생종의 발생배에서는 신경기원의 의배영 세포로부터 신경원세포와 하피 (下皮) 세포가 분화된다. 그러나 Notc h 발생 배에서는 모든 신경기원의 의배영세포는 신경원세포로만 분화한다.

경계 형성 부위의 세포들은 표피 혹은 신경계의 전구 세포가 된다 (Hart en ste in and Camp os -Or teg a , 1984). 그러나 Notc h 유전자가 발생 중 전사되지 않으면, 이들 세포들은 모두 신경계 전구 세포로 분화된 다 (Lehmann et al., 1983 ; Artav ari s-T sakonis e t a l., 1983). 이러한 발생 배에서는 배측 및 머리 부위의 표피 세포를 모두 신경계 세포로 전환 시켜 신경계 세포가 과잉으로 생산되기 때문에 이 발생배는 결국 죽 게 된다 (Poulson, 1937 ; Hop pe and Greenspa n , 1986) . Notc h 유전자를 클로운하여 조사해 본 결과 발생 초기에 전사되는 것으로 관찰되었다 (Ki dd et al., 1983 ; Yedvobnic k et al., 1985) . Notc h 유전자와 lin- 12 유전자는 모두 표피 생 장요인 (ep ide nnal grow th fac to r , EGF) 의 유전자의 염기 배열과 상당히 유사한 것으로 나타났다. Notc h 단백질 N- 말단 부위는 EGF 와 같은 펩티드를 36 군 데에서 반복적으로 가지고 있는데, 이 펩티드의 특칭은 세포막 밖으 로 돌출된 모양으로 막에 부착되어 있다 (Wha rt on et al., 1985). lin - 12 유전자의 생성물도 최소한도 11 개의 EGF 와 유사한 펩티드를 가지고 있으며 막에 부착되어 있는 것으로 생각되고 있다.

10.5 一 El E2 E3 E4~ ES :EI6 E7 ES E...9.. ,ElO E..l.l E12 E13

그림 5-30 초파리 야생종에서의 배발생중 No t ch 유전자 발현의 변화. Noth e m blo t법으로 측정하였다. 숫자는 2 5°C 에서의 발생시간을 의마한다 (Yedvob­ nic k et a l., 1985) .

sevenless 라는 swi tch g ene 에서도 막에 부착되 어 있는 성 장요인 수 용분자와 갇은 단백질이 만들어진다는 사실이 알려지고 있다. 이 유 전자는 초파리 의 마지 막 유충기 의 눈 성 체 원기 (ey e im ag ina l disc ) 에서 발현되는대, 망막 세포가 자의선 광수용 세포나 혹은 비신경성 추세

?`ir , ,i i ‘`.‘. ’.

그림 5-31 Sevenless mRNA 의 위치. 야생종의 Sevenless DNA 울 방사능 동 위원소로 표지하고 제한효소로 토막내어 in situ 재결합하여 자기방사하였 다. (A) 유충의 뇌 부위 (br, pv, vs) 와 눈 성체 원기 (ed). (B) 표지된 DNA 가 눈 성체원기부위의 mRNA 에만 재결합한다 (Ha f en et a l., 1987).

포 어느 쪽으로 분화할 것인지를 결정하는 역할을 한다. 만약 sevenless 유전자가 전사되면 이들 세포들은 신경세포로 그 운명이 결정되고, 만약 전사되지 않으면 추세포로 그 운명이 결정된다 (Banerj ee et a l., 1987 ; Hafe n , et a l., 1987}. 세포의 가능한 분화 방향이 두가지일 때 lin- 12, Notc h 및 sevenless 유전자는 그 방향을 결정해 준다. 이러한 유전자의 생성물이 작용하는 과정에서 대단히 중요한 공통점은 세포 상호작용으로 생각되고 있는데, 그 이유는 이들 조절 단백질이 막에 부착되어 있어 다른 세포의 표면과 상호작용을 할 수 있도록 되어 있기 때문이다. 참고문헌 Artav ani s- Tsakon is, S., Muskavi tch , M.A.T. and Yedvobn ick , Y. (1983) . Molecular clon ing of Notc h , a locus affe c ti ng neurog en esis in Drosop h ila melanoga s te r. Proc. Natl. Acad. Sci . USA so: 1977

-1981 . Ashburner, M. (1972a) . Patt er ns of puf f ing acti vity in the saliv a ry gla nds of Drosop hi la . VI. Inducti on by ecdy so ne in saliv a ry gla nds of D. melanoga .ster cultu r ed in vitr o. Chromosoma 38: 255-281. Ashburner, M. (1972b) . Puff ing pat t er ns in Drosop hi la melanoga .ster and relate d spe c i es . In W. Beerman (ed.) , Develop m enta l Stu d ie s on Gia n t Chromosomes, Spr i n g e r -Verlag, Berlin , p p. 101-151 . Ashbumer, M. (1974) . Seq ue nti al gen e acti va ti on by ecdy so ne in pol yt en e chromosomes of Drosoph i la melanoga .ster . I I. Eff ec ts of inh ib i t or s of pro te i n syn the sis . D ev. Bio l. 39: 141-157. Banerjee , U., Renfr an z, P.J., Pollack, J.A. and Benzer, S. (1987) . Molecular characte r iz a ti on of sevenless, a gen e inv olved in neur- onal pat t er n for mati on in the Drosop hi la eye . C ell 49: 281-291. Barnett, T., Pachl, C., Gerge n , J.P. and Wensin k , P.C. (1980) . The iso lati on and characte r iz a ti on of Drosop hi la yol k pro te i n gen es. Cell 21: 729-738. Beermann, W. 1971. Eff ec t of a-aman itine on pu ff ing and int r a nu- clear RNA syn the sis i n Chir o nomus saliva ry gla nds. Chromosoma, 34: 152-167. Bog en hage n , D.F., Sakonju , S. and Brown, D.D . (1980) . A contr ol regi on in the cente r of the 5 S RNA gen e Bonner, J.T . and Pardue, M. L. (1977) . Ecd y sone-s ti m따 a t ed RNA syn the sis in saliv a ry gla nds of Drosoph i la melanoga .ster : Assay by in situ hyb rid i z a ti on . Cell 12: 219-225. Britt en , R.J. and Davi ds on, E.H . (1971) . Repe t it ive and nonrepe t i tive DNA sequ e nces and a s pec따 a ti on on the orig ins of evoluti on ary novelty. Q. Rev. Bio l. 46: 111-133. Britt en , R.J. and Kohne, D.E. (1968). Repe a te d sequ e nces in DNA.

Sci en ce 161: 529-540. Brown, D.D . (1981) . Gene exp re ssio n in eukaryo t e s . S cie n ce 211: 667 -674. Chamberlain , H.E. , Britt en , R.J. and Dav ids on, E .H. (1975) . Sequ e nce orga n iz a ti on in Xenop us DNA stu d ie d by the electr o n mi cr oscop e. ]. Mol. Bio l. 96: 317-334. Clarkson, S.G . , M .L. Bir n sti el , a nd V. Serra. 1973. Reit er ate d tra nsfe r RNA gen es of Xenop us laevis . J. M ol. Bio l. , 79: 391-410. Clever, U. 1961. Genak ti v it셨t en in den Rie s enchromosomen von Chir o nomus ten ta n s und ihr e Bezie h ung en zur Entw ic k lung. I. Genakti vier ung en durch Ecdy so n. Chromosoma, 12: 607- 67 5. Clever, U., and P. Karlson. 1960. Indukti on von Puff .ve randeri lng e n in den Spe i c h eldri lse nchromosomen von Chir o n om us ten t a n s durch Ecdy so n. Exp. Cell. Res., 2 0: 623- 62 6. Consta n tin i, F.D., Scheller, R.H. Britt en , R.J. and David s on, E.H . (1978) . Rep et it ive seq ue nce tran scrip ts in the matu r e sea urchin oocyt e. Cell 15: 173-187. Davi ds on, E.H ., and R.J . B rit ten . 1973. Orga n iz a ti on , tra nscrip tion , and regu la ti on in the ani m al gen ome. Q. Rev. Bio l. , 48: 565- 61 3. Davi ds on, E.H ., Graham, D.E. , New feld , B.R., Chamberlain , M. E., Amenson, C.S ., Houg h, B.R. and Britt en , R.J. (1973a) . Arrang e- ment and characte r iz a ti on of repe ti tive sequ e nce elements in ani- mal DNAs. Cold Sp ring Harbor Sym p. Quan t. Bi ol. 38: 295-301. Davi ds on, E.H ., Houg h, B.R., Amenson, C.S . and Brit ten , R.J. (1973b) . General int e r spe r sio n of repe t i tive wit h nonrepe t i tive sequ e nce elements in the DNA of Xenopu s. ]. Mol. Bio l . 7 7: 1-2 4 . DuPraw, E.J . 1970. DNA and Chromosomes. Holt , Rin e hart & Wi n- sto n . New York.

Edelman, LS. 1975. Mechanis m of acti on of ste r oid hormones. J. Ste r oid Bio c hem., 6: 1 47-159. Eng el ke, D.R ., Ng , S. -Y., Shastry , B.S. and Roeder, R.G . (19so) . Spe c i fic int e r acti on of a pur ifi ed tra nscrip tion fac to r wit h an int e r nal contr o l regi on of 5S RNA gen es. Cell. 19: 717-728. Fin c h, J.T ., Noll, M. and Kornberg, R.D . (1975) . Electr o n mic r oscop y of d efi ne d leng ths of c hromati n. Proc. natl . A cad. Sci. USA 72: 3320 -33 22. Foe, V.E., Wi ki n s on, LE. and Lair d , C.D . (1976) . Comp ar ati ve orga - niz a ti on of a cti ve tra nscrip tion unit s i n Oncop e ltu s fasc ia tus. Cell 9: 131- 14 6. Gazit , B., Panet, A. and Cedar, H. (1980) Reconsti tut i on of deoxy r- ibo nuclease I-se n sit ive stru ctu r e on acti ve gen es. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1787-1790. Gin s berg, A.M. , K in g , D.O . and Roeder, R.G . (1984) . Xenop u s 5S gen e tra nscrip tion fac to r , TFIIIA: Characte r i za ti on of a cDNA clone and measurement of RNA levels throu g ht o u t develop m ent. Cell 39: 479-489. Greenwald, LS. (1987) . The lin- 1 2 locus of Caenorhabditi s elega n s. Bio E ssays 6: 70-73. Greenwald, LS., Ste r nberg, P.W . and Horv itz, H.R . (1983) . The lin- 12 locus spe c i fies cell fates in Caenorhabditi s eleg a ns. Cell 34: 435-444. Gronemeye r , H. and Pong s, 0. (1980) . Localiz a ti on of e cdys t e r one on pol yt en e chromosomes of Drosop hil a melanoga s te r. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 21os-2112. Gurdon, J.B . 196Ba. Chang es in somati c cell nuclei inse rt ed int o grow i ng and matu r in g amp hibi a n oocyt es . J.Em bry o l. Exp. Mor- pho l., 20: 401-414.

Gurdon, J.B. 1968b. Transpl a nte d nuclei and cell dif fer enti at i on Sci. Am. , 2 19(6) : 24-35. Hafe n , E., Basler, K., Edstr o em, J-E . and Rubin , G.M. (1987} . Sev en- less, a cell-spe c i fic homeoti c gen e of Drosop hi la , encodes a pu ta t i ve tra nsmembrane recep tor wit h a tyros in e kin a se domain . Scie n ce 236: 55-63. Harris, S.E ., Rosen, J.M ., Meens, A.R. and O'Malley, B.W . (1975}. Use of spe c i fic pro be for ovalbumi n messeng er RNA to qua nti tat e estr o g en -in d uced tra nscrip ts. Bio c hemi stry 14: 2072-2081 . Harte n ste i n , V . and Camp o s-Orte g a , J.A. ( 1984} . Early neurog en esis in wild- ty pe Drosop hi l a melanoga s te r. Wi lh elm Ro 邸 Arch. Bio l. 193: 308-325. mic r oscop e analys i s. ]. Cel l Sci . 44: 87-101 . Hewi sh , D.R . and Burgo yn e , L.A . (1973} . Chromati n substr u ctu r e. The dige sti on of chromati n DNA at regu la rly spr e ad site s by nuclear DNase. Bio c hem. Bio p h y s . Res. Commum. 52: 504- 51 0. Hood, L.E. , Wi lso n, J.H . and Wood, W.B. (1975}. The Molecular Bio lo gy of Eukary o tic Cells. Benja m i n, New York. Hop pe , P.E . and Greenspa n , R.J. (1986} . Local fun cti on of the Notc h gen e for embry on i c ecto d ermal pat h w ay choic e in Drosop hi la . Cell 46: 773-783. Karlsson, S. and Nie n haus, A.W . (1985} . Developm enta l regu la ti on of human glo bin gen es. A nnu. Rev. Bio c hem. 54: 1071-1108. Kedes, L.H . 1979. Histo n e gen es and hist o n e messeng er s Ann. Rev. Bio c hem., 48: 837-870. Kid d , S., Lockett , T.J. and Young, M.W. (1983) . The Notc h locus of KiDinrmoseo lp, hAi .lRa . maenlda nFoigr a tse tle, rR. .CAe. ll( 13947:9 4) 2.1 A-4 3fa3m. ily of short int e r spe r sed repe a t sequ e nces at the 5' end of a set of 屈 c ty os t el i um sin g l e cop y

mRNAs. Cell 16: 787-796. Kmi ec , E.B ., Razvi, F. and Worcel, A. (1986). The role of DNA -media t e d tra nsfe r of TFIIIA in the concert ed gyrat i on 1nd dif fere nti al acti va ti on of the Xenop us 5S RNA gen es. Cell 45: 209 -218. Kmi ec , E.B. and Worcel, A . (1985) . The pos it ive tra nscrip tion fac to r for the 5S RAN gen e ind uces a 5S DNA- sp e c if ic gyrat io n in Xenop us oocyt e extr a cts . Cell 41: 945-953. Korge , G. 1975. Chromosome puf f acti vi ty and pro te in syn the sis in larval saliv a ry gla nds of Drosoph il a melanoga s te r. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A . , 72: 4550-4554. Korge , G. 197 7. Dire ct correlati on betw e en a chromosome puff and the syn the sis o f a larval saliv a pro te i n in Drosop hi la melanoga s te r . Chromosoma, 62: 155-174. Korn, L. (1982) . Transcrip tion of Xenop us 5 S rib o somal RNA gen es. Natu re 295: 101- 10 5. Labhart, P. and Koller, T. (1982). Str u ctu r e of the acti ve nucleolar chromati n of Xenop us laevis oocy tes . Cell 28: 279-292. Lehmann, R., Jim enez, F., Diet r ic h , U. and Camp o s-orte g a , J.A. (1 983) . On the phe noty pe and develop m ent of muta n ts of early neurog en esis i n Drosop hi la melanog as te r. Wil h elm Roux Arch. Dev. Bio l. 192: 62-74. May field , J.E., Serunia n , L.A., Silv e r, L.M . and Elgi n, S.C.R. (1978) . A pro te i n released by DNase I dig es ti on of Drosop hil a nuclei is pre fe re nti all y assoc iat e d wit h puf f s. Cell 14: 539-544. McKnig h t, G.S., P. Pennequ i n , and R.T . Sch im ke. 1975. Inducti on of ovalbw nin m RNA sequ e nces by estr og e n and pro g es te r one in chi ck ovi du ct as measured by hyb r id iza ti on to comp le menta r y DNA . J.

Bio l. Chem. , 2 50: 8105- 8 110. Meye r owi tz, E.M . , a nd D.S. Rog ne ss. 1982. Molecular orga n iz a ti on of a Drosop hila pu ff site tha t respo nds to ecdy so ne. Cell. 2 8 : 165- 1 76. Moen, R.C., and R.D. Palmi ter. 1980. Chang es in hormone respo n - siv e ness of chi ck ovid u ct durin g pri m ary stim ulati on wit h estr og e n . Dev. Bio l. , 7 8: 450-463. Mi ge on, B.R., Schmi dt , M., Axelman, J. and Cullen, C.R. (1986) . Comp le te reacti va ti on of X chromosomes from human chorio n ic villi with a swi tch to early DNA repl i ca ti on . Proc. Natl. Ac ad . Sci. USA 83: 2182-2186. Mi geo n, B.R., Wolf , S.F., Axelman, J., Kaslow, D.C . and Schmi dt , M. (1985) . Incomp le te X chromosome dosage comp e nsati on in chor- ion i c villi of human pla centa . Proc. Natl. Acad. Sci . U SA 82: 3390 -3394. Mi ller, D.L , Jr. and Beatt y, B.R. (1969) . Vis u aliz a ti on of nucleolar gen es. Sci en ce 164: 955-957. Mille r, J., M cLachlan, A.D . and Klug , A. (1985) . Repe t i tive zin c -bin d in g domain s in the pro te i n tra nsci rp t ion fac to r IIIA from Xenop us oocy tes . EMBO J 4: 1609- 1 614. Monk, M. and Harp e r, M.I. (1979) . Sequ enti al X chromosome ina cti va ti on coup le d wit h cellular differ enti at i on in early mouse embry o s. N atu r e 281: 311-313. Moore, K.L. (1977) . The Develop ing Human. Saunders, Ph ila delph ia . Morga n , T.H. (1934) . Embry ol ogy and Geneti cs. Columbia Un ive rsit y Press. New York, pp. 9-10. Ng , S-Y., Parker, C.S. and Roeder, R.G . (1979) . Transcrip tion of cloned Xenopu s laevis RNA po lym e rase III in reconsti tut e d sys - ter ns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 136-140.

Noll, M. (1974) . Subunit stru ctu r e of c hromati n. Natu r e 251: 249-251 . O'Malley, B.W. et al. 1975. Ste r oid hormone regu la ti on of spe c i fic messeng er RNA and pro te i n syn the sis i n eucaryo t ic cells. J. C ell. Phy si o l. , 8 5: 343-356. Outl et, P., Gross-B e llard, M. and Chambon, P. (1975). Electr o n mic ro scop e and bio c hemi ca l evid e nce tha t chromati n s tru ctu r e is a repe a ti ng unit . Cell 4: 281-300. Palmi ter , R.D . and Schim ke, R.T. (1973) . Reg ula ti on of pro te i n syn t h e sis in chic k ovid u ct. III. Mechani sm of ovalbumi n supe r in d ucti on by acti no my cin D.J Bio l. Chem. 248: 1502-1512. Papa y a n nop ou lou, T., B ric e, M. and Sta m ato y a n nop ou los, G. (1986) . Analys i s of human hemog lo vin swi tch in g in MEL X human fet a l eryth ro id cell hyb r id s . Cell 46: 469-476. Pardue, M.L. and Gall, J.F. (1 970) . Chromosomal localiz a ti on of mouse sate ll ite DNA . Scie n ce 168: 1356-1358. Pardue, M.L . 1973. Localiza ti on of repe a te d DNA sequ e nces in Xenop us chromosomes. Cold Spr i n g Harbor Sym p. Qu ant. Biol. , 38: 475-482. Pardue, M.L ., D.D. Brown, and M.L. Bim stie l. 1973. Locati on of the gen es for 5 S rib o somal RNA in Xenop us laevis . Chromosoma, 42: 191-203. Pardue, M. L., and JG . Gall. 1972. Chromosome stru ctu r e stu d id e d by nucleic aci d hyb r id i sa ti on in cyt ol og ica l pr~ p ar ati on s. Chromo- somes Today; 3: 47-52. Pie le r, T., Oei, S. -L., Hamm, J., Eng el ke, U. and Erdmann, V.A. (1985) . Functi on al domain s of the Xenop us laevis 5 S gen e pro - mote r . EMBO J 4: 3751-3756. Poulson, D.F. (1937) . Chromosomal defi cie r ci es and the embry o ni c

develop m ent of Dr os op h ila me la n og a ,ster . Proc. Natl . Acad. Sci . USA 23: 133-137. Raff , R.A. and Kaufm an, T.C. (1983) . Embry os , Genes, and Ev ol uti o n . Macmi llan , New York. Roop , D.R. , Nordstr o m, J.L., Tsai, S.Y. , T sai, M-J. and O'Malley, B. W. (1978) . Transcrip tion of s tr u ctu r al and int e r venin g sequ e nces in the ovalbumi n gen e and ide nti fica ti on of po te n ti al ovalbumi n mRNA pre cursors. Cel l 15: 671- 68 5. Rubin , G.M., Brosein , W.J. , Dunsmuir , P., Flavell, A.J ., Lavis , R., Str o bel, E., Toole, J.J. and Young, E. (1980) . Cop ia- li ke tra nspo s a- ble elements in Drosop h ila gen ome. Cold Spr ing Harbor Sym p . Qu ant. Bio l. 45: 619-628. Ry ffel, G.U ., Muellener, D.B. , Wy le r, T ., W ahli, W . and Weber, R . (1981) . Transcrip tion of sin g l e -cop y vit ell og en i n gen e of Xe nop u s inv olves expr e ssio n of mid d le repe t i tive DNA . Natu r e 291: 429-431. Sakonju , S., Bog en hage n , D.F. and Brown, D.D. (1980) . A contr ol regi on in the cente r of the 5 S RNA gen e dir e cts spe c i fic ini t iat i on of tran scrip tion . I. The 5'border of the regi on . Cell 19: 13- 25 . Sakonju , S. and Brown, D.D. (1982) . Conta c t po in t s betw een a po si- tive tra nscri ption fac to r and the Xenop u s 5 S RNA gen e. Cell 31 : 395-405. Sheph e rd, J.H . et al. 1980. Com mitm ent of chic k ovid u ct tub ular gla nd cells to pr? duce ovalbumi n mRNA durin g hormonal wit h- drawal and restim ulati on . J Cell Bio l ., 87: 142- 15 1. Sh im oto h no, K., and Tem in, H.M. (1980) . Evoluti on of retr o v iru ses from cellular moveable gen eti c elements . Cold Spr ing Harbor Sym p. Quan t. Bio l 45: 719-730. Sta m ato y a n nop o ulos, G., Consta n to u lakis , P., Bric e . M. , K urachi , S.

and Papa ya n nop o ulou, T. (1987) . Coexp re ssio n of embry o nic , fet a l , and adult glo bin s in ery throi d cells of human embry os : Relevance to the cell-lin e age models of g lo bin swi tch in g . Dev. Bio l. 123: 191-197. Thomas, J.O . , a nd A.J, A. Khabaza. 1980. Cross-lin k in g of hist o n e HI in chromati n. Eur. J.B i oc hem., 112: 501-511 . Thomas, J.O . , a nd R.D . Kornberg. 1975. An oct am er of his t o n es in chromati n and free in soluti on . Proc. Natl . Acad. Sci . U.S .A., 72: 2626~2630. Wein t r a ub, H. and Groudin e , M. (1976) . Chromosomal subunit s in acti ve gen es have an alte r ed config ura ti on . Scie n ce 193: 848-856. Weis b rod, S., G roudin e , M. and Wein t r a ub. H. (1980) . Inte r acti on of HMG 14 and 17 wit h acti ve ly tra nscrib i n g gen es. Cell 19: 289-301 . Weis b rod, S. and Wein t r a ub, H. (1979) . Isolati on of a subclass of nuclear pro te i n s respo n sib l e for con fer rin g a DNase I-sensit ive str u ctu r e on glo bin chromati n. P roc. Natl . A cad. Sci. USA 76: 630 -6 34. Wharto n , K.A., Joh ansen, K. and Ar tav anis - Tsakonas, S. (1985) . Nucleoti de sequ e nce from the neurog en ic locus Notc h im p li es a gen e pro duct whic h shares homolog y wit h p ro te i n s conta i n ing EGF -lik e repe a ts . Cell 43: 567-581. Wollff e, A.P. , Andrews, M.T., C raw for d, E., Losa, R. and Brown, D. D. (1987) . Nega t i ve sup er coil in g is not requ i re d for 5 S RNA tra nscrip tion in vitro . Cell 49: 301-303. Yedvobnic k , B., Muskav itch , M.A . T ., Whart on , K.A ., Halpe r n, M. E., Paul, E., Grim wade, B.G . and Artav anis - Tsakonas, S. (1985) . Molecular gen eti cs of D rosop hi la neurog en esis . Cold Sp ring Harbor Sym p. Quan t. B io l. 50: 841-854.

제 6 장 진핵세포 유전자의 분자 구조와 유전자 발현의 조절 1 진핵세포 유전자의 분자 구조 1970 년대까지 유전자 구조에 대한 지식은 주로 원핵세포의 유전자 구조에 의존해 왔다. 즉 단백질의 아미노산 서열과 이를 지시하는 유 전자의 염기서열은 언제나 병행하며, mRNA 의 5' 쪽이 단백질의 아 미노기 말단을 지시하기 시작하여 각 코돈 (codon) 이 순서에 따라 카 르복실기 말단까지 아미노산으로 해독된다는 것이었다. 그러나 진핵 세포 유전자의 분자적 구조의 특징이 이러한 원핵세포의 유전자의 것 과는 다르다는 점을 알게 되었다. 죽 진핵세포의 구조 유전자들은 서 로 인접되어 있지 않고 대부분의 경우 분리되어 있다. mRNA 의 5' 과 3' 쪽이 각각 이러한 부위의 유전자에서 유래하며 단백질을 지시하 는 DNA 부위 죽 exon 사이에 단백질의 아미노산 서열과는 아무런 관계가 없는 i n t ron 이 삽입되어 있다. 사람의 8- 글로빈유전자의 분자

구조적 특칭을 보면 다음과 같다. CD pro moto r : RNA 중합효소의 결합부위로서 f3 - 글로빈유전자에 서는 전사 개시 부위 전 95 번에서 26 번에 자리하고 있는 영기쌍으 로 이루어져 있다. ® 전사 개시 부위 : ACATTTG 의 염기서열을 가지는 전사 개 시 부위는 cap 배열이라고도 하는데, 일단 전사되면 RNA의 5 ' 말 단에 위치한다. ® ATG 코돈 : 해독 개시 부위로서 전사 개시 부위 후 50 번째의 염기쌍에 자리하고 있다. 전사 개시 부위와 해독 개시 부위 사이의 50 개의 영기쌍으로 구성된 i n t ron 은 leader se q uence 라고 불린다. © exon : 글로빈의 아미노산 서열을 지시하는 염기쌍들로서, f3-글로빈유전자에는 3 개의 exon 이 있다. 첫번째 exon 은 글로빈 단백질의 구성 아미노산 1 번에서 30 번을 지시하는 90 개 염기쌍으로 되어 있고, 두번째 exon 은 구성 아미노산 31 번에서 104 번을 지시 하는 222 개의 염기 쌍으로 되어 있고, 세번째 exon 은 구성 아미노 산 105 번에서 146 번까지 지시하는 126 개의 영기쌍으로 되어 있다. @ int r on : exon 사이에 자리하고 있으며 전사는 되지만 아미노 산을 지시하지 않는 부위이다. f3-글로빈유전자에는 두 개의 int r o n 이 있는데, 첫번째 i n t ron 은 130 개의 염기쌍으로 이루어진 첫번째 exon 과 두번째 exon 사이에 자리하는 것이며, 두번째 i n t ron 은 두

p(roA m) o전te 사r r개eg시i o부n 위I a(해 a독l! ~개 시:부f위 f0a’4 Intr o n 2 감I 나:해1독( 정 지부二I위 / ;전정 사지부 위

(B) cccc g,gg三t a gggttg죤호 c t ac t ccca gg a g ca ggg a ggg ca gg a g cca ggg c tgg로호프]

그림 6-1 사람의 8- 글로빈유전자의 누클레오티드 배열순서. (A) p romo t er 부 위, 전사개시부위 (cap ), leader seq ue nce, exon, i n t ron 의 위치. exon 의 양쪽에 있는 숫자는 아미노산의 순서에 해당한다. (B) 누클레오티드의 배 열순서. pro mot er 부위 개시 및 정지코돈에 대한 누클레오티드 배열순서 (ATG, TAA) 는 모두 조그만 상자 속에 넣었다. 대문자는 exon 에 해당하 며, 그 위에 지시되는 아미노산을 약자로 표기하였다. 소문자는 i n tr on 에 해당한다. 대문자로 표기했으나 아미노산이 없는 부분은 전사는 되지만 해 독되지 않은 부위이댜 여기에는 p ol y aden y la ti on 에 필요한 hexanu- cleo ti de 가 있다. 첫번째 i n tr on 에 자리하고 있는 G( 화살표)가 A 로 돌연변 이되면 p+th alassem i a 를 일으킨다 (Lawn et al ., 1980).

번째 exon 과 세번째 exon 사이에 자리하는 850 개의 염기쌍에 해당 한다. ® 해독 정지 코돈 : 세번째 exon 의 3 ' 말단에 인접해 있는 TAA 로 되어 있다. (j) trai le r regi on : 세번째 exon 의 3' 말단에서 전사가 끝나는 것 이 아니고 비록 단백질로 해독되지는 않아도 전사되는 부위가 있 다. 이 염기 부위에는 특별히 AATAAA 가 있는데 RNA 로 전사된 후 200~300 개 정도의 아데노신 염기를 꼬리로 붙이는 데 필요한 부위이다. p ol y (A) 꼬리는 AAUAAA 부위에서 하위로 20 개 염기 떨 어진 부위의 RNA 에 삽입된다. 그러나 전사는 AATAAA 에서 끝 나지 않고 이 부위를 지난 다음에도 약 1000 개의 염기로 된 부위에 걸쳐 일어난다. 만약 AATAAA 부위에 돌연변이가 일어나면 전사 는 되 지 만 po ly ( A) 꼬리 는 첨 가되 지 않는다, trai l e r re gi on 에 는 성 체 적혈구세포에서의 /3 - 글로빈유전자 발현조절에 필요한 부위로서 AATAAA부 위로부터 600 내지 900 염기쌍에 해당하는 enhancer 가 있다 (Trudel and Consta n ti ni, 1 987) . 이러한 유전자가 전사되면 전사체인 nuclear RNA(nRNA) 는 cap 염 기 부위 , leader sequ e nce, exon, int r o n 및 3' 말단에 해 독되 지 않는 염기 부위로 이루어진다. 전사 후 양 말단에 변화가 일어나는데, RNA 의 5' 말단에 있는 ca~ 본 메철화된 gu anos i ne 이 RNA 염기의 결 합방향과는 반대방향으로 결합된다. 죽 모든 염기가 5' 에서 3' 으로 결합되는 반면에 ca p에서는 5 ' 에서 5 ' 으로 결합된다. 따라서 nRNA 에는 5' 인산기가 없다. messeng er RNA 에도 ca p이 있는데 이 ca p이 nRNA 의 것과 동일한 것인지는 확실치 않다. rnRNA 에서의 5'ca 硏본 rnRNA 가 리보솜에 안착할 때 필요한 것으로 이해되고 있다 (Sha t k i n, 1976) . 3' 말단은 약 200 개 정도의 아데노신 영기가 주로 핵내에서 첨가됨 으로써 변화된다 . 아들 아데노신 염기의 첨가는 유전자에 의해 조절

RNA 중합요소 경합TT C건CT사Tl개A 시C 해독I개 시 ATG 해독정지 TAA 첨APAo가lTy조AA 정A ‘ A 부전^J 정지

(A)

그림 6-3 진핵세포의 mRNA 5' 말단에서의 capp ing , (A) ca ppi n g전의 5' 말단, (B) 5'cap, 7-me thy l gu anos i ne 이 mRNA 의 5' 말단과 5'-5' 의 결합을 하고 있다. (Rott ma n et al., 1974)

되는 것이 아니고 전사 후 효소에 의해 성취된다. 이러한 RNA 의 5' 과 3' 말단에서의 변화 때문에 RNA 는 exonuclease 로부터 보호를 받 는 다 (Shein e ss and Darnell, 1 973 ; Gedamu and Dixo n, 1978) . 즉, pol y (A) 첨가로 인하여 mRNA 가 안정된다. 그러나 시간이 지나면 Poly (A) 꼬리는 점차 짧아지면서 안정성을 잃게 된다. 새로 합성된 글로 빈 m-RNA 의 pol y( A ) 꼬리는 처음에는 150 개의 아데노신으로 이루 어져 있으나 시간이 지남에 따라 100 개 , 60 개 혹은 40 개의 아데노신 으로 감소하는 경우도 찾아볼 수 있다 (Merkel et a l., 197 5 ; Nokin et al., 1976). p ol y (A) 꼬리가 결여된 글로빈 mRNA 를 X e no p u s 의 난모 세포에 주사해 주면 mRNA 는 쉽게 붕괴된다. 따라서 p ol y (A) 는 mRNA 를 안정시키는 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. mRNA 는 핵 속에 갇혀 있는 한 그 기능을 발휘할 수 없다. 원핵 세포에서는 전사와 해독이 거의 동시에 일어날 정도로 밀접하게 연결 되어 있지만 진핵세포의 RNA 는 원핵세포의 것과는 달리 반드시 핵 밖으로 나와야만 그 기능을 발휘할 수 있다. 지난 수년 동안에 누적 된 연구결과에 의 하면 i n t ron 이 mRNA 를 핵 에서 세포질로 이동시 키 는 데 중요한 역할을 하는 것으로 생각되고 있다. mRNA 의 전구체 에 i n tr on 이 존재한다는 사실은 전자현미경으로 쉽게 확인될 수 있 다. 즉 B- 글로빈 mRNA 에 대 한 cDNA 를 준비 하여 핵의 RNA 전구 체에 결합시킨 후 전자현미경으로 확인해 보면 i n t ron 이 결합되지 못 하고 고리모양(l oo p)으로 밀려나오는 것을 관찰할 수 있는데, 이러한 i n t ron 은 mRNA 전구체가 핵을 탈출하는 데 필요한 것으로 생각되 고있다. 가장 직접적인 증거의 하나로서 글로반유전자를 바이러스에 삽입시 킨 후 i n t ron 의 유무에 따라 출현하는 굴로빈 mRNA 의 존재를 확인 하는 것이다. 우선 글로빈유전자를 삽입시킨 후 그 바이러스를 진핵 세포에 감염시키고 그 유전자로부터 전사된 RNA 를 관찰한다. 만약 바이러스의 유전자나 글로빈유전자에 i n tr on 이 존재하면 글로빈

mRNA 가 세포질에 출현하지만 i n t ron 이 어느 유전자에나 결여되어 있으면 글로빈 mRNA 는 전혀 생성되지 않는다. 또 다른 실험적 증거는 /3 + 탈라세미아(/3 + -t halassem i a) 질병에 관한

(A) Exon I Intr o n Exon 2

(B)

연구로부터 얻을 수 있는데, 이 질병을 앓는 환자에게는 8- 글로빈의 생성이 대단히 낮다. 이러한 이유는 환자에게 8- 글로빈유전자가 결 핍되어 있기 때문이 아니고 RNA p rocess i n g에 문제가 있는 것으로 알려졌다. 8+ 탈라세미아 환자의 8- 글로빈유전자는 정상적으로 전사 하며, 전사된 mRNA 는 정상적으로 해독될 수 있다. 그러나 문제는 g-글로빈 mRNA 가 양적으로 대단히 적다는 데 있다. 8- 글로빈 mRNA 의 양적 부족을 pul se-chase 실합을 통해 알아냈다 (Ma q ua t et al., 1980) . 즉 환자의 골수로부터 적 혈구를 분리 하여 12 분 동안 방 사 능 동 위 원 소 를 표 지 한 염 기 로 짧 게 표 지 (pu lse) 한 다 음, acti no my cin D 를 처리하여 전사를 중지시켰다. 그 후 시간 간격을 두고 세포로부터 RNA 를 추출하여 전기영동으로 분리시킨 다음 그 RNA 와 8- 글로빈 cDNA 를 결합시켰다. 정상인에서는 표지 직후 cDNA 와 결합하는 RNA 의 염기수가 1900 개이지만 얼마 후에는 1550, 1150, 960 및 880 염기로 염기수가 감소하였고 2~3 분 이내에 85% 의 RNA 가 mRNA 로 존재하는 것을 관찰할 수 있었다. 맑탈라 세미아 환자의 적혈구에서도 RNA의 중간형이 형성되기는 하지만 30 분이 지나도록 메시지 크기의 RNA 는 보이지 않는 점으로 보아 아마 도 중간형의 RNA 가 mRNA 로 성숙하지 못하여 세포질 속으로 나오 지 못하고 핵 속에 그대로 남아 있는 것으로 생각되었다 (Ma q ua t e t al., 1980_; K anto r et a l., 1980}. 따라서 8+ －탈라세 미 아는 8 곱굴로빈 mRNA의 p rocess i n g에 결함이 있기 때문에 일어나는 질병으로 생각 되었다. 그러나 8- 글로빈유전자의 염기 배열 순서를 조사해 보면 첫 번째 i n t ron 에 돌연변이가 일어난 것을 알 수 있는데, 아마도 이 질 병은 돌연변이로 인하여 RNA p rocess i n g에 관여하는 i n t ron 의 기능 이 상실되었기 때문에 일어난 것으로 추측되고 있다.

* p luse-chase 실험 : 방사능 전구물질로 짧은 기간 동안 표지한 다음 표지 되지 않은 전구물질에 옮겨 놓음으로써 일단 표지된 방사능 전구물질을 추적하는 실험.

2 p romo t er 의 구조와 기능 (1 ) p romo t er 의 구조 유전자 발현 조절 요인에는 크게 나누어 ci s 조절요인과 t rans 조절 요인의 두 종류가 있다. 즉 c i s 조절요인은 인접 유전자에 작용하여 유전자 발현을 조절하는 특정 DNA 부위에 해당한다. t rans 조절요인 은 DNA 로부터 만들어졌으나 염색체에 작용하여 유전자 발현을 조철 한다고 생 각되 는 RNA 와 단백 질과 같은 요인 이 다. E. col i의 lac o p eron 에 의한 선택적 유전자 발현 유도과정에서 억제단백질이 t rans 조절요인에 해당하며 작동유전자는 c i s 조절요인에 해당한다. 진핵세포의 구조 유전 자 에는 두 가지 형태의 ci s 조절인자 즉 p romo t er 와 enhancer 가 있다. 진핵세포에서 p romo t er 는 전사 개시 부위 에서 상위 (up st re am) 에 자리 하는 약 100 개의 염 기쌍에 해 당한다. 구조 유전자의 p romo t er 는 RNA 중합효소 Il 가 결합되는 부위로서 정확한 전사 개시를 돕는디. enhancer 는 p romo t er 를 활성화시켜 전 사의 능률 및 속도를 조절한다. 그러나 enhancer 는 반드시 전사 개 시 부위의 상위에 자리하거나 혹은 동일한 DNA 사슬에 자리하지 않 을 지라도 그 역할을 수행할 수 있다 (Ma ni a ti s et a l., 1987). 비교적 다량의 mRNA 를 전사하는 p romo t er 들은 공통적인 부위를 가지고 있다. 한때는 TATA 상자나 Goldber g -Ro gn ess 상자로 알려졌 던 ATA 염기배열은 전사 개시 부위에서 상위로 30 염기쌍 떨어전 곳에 자리하고 있고, 그 위로 한 개 혹은 그 이상의 상위 pro mote r 가 있을 수 있다. 상위 p romo t er 는 CAAT 배열의 변이형태이지만 이 의 에 도 다른 종류의 상위 p romo t er 가 발견되 기 도 한다 (Gros. 5Che dl and Bir n stie l, 1950 ; McK nigh t a nd Tji an , 1986) . /3-글로빈유전자의 p romo t er 가 처음으로 분석되었다. 클로운된 유 전자를 양서류의 난모세포나 섬유아세포의 핵 속에 혹은 세포 상등액

에 누클레오티드와 RNA 중합효소와 함께 넣어 주면 이 유전자는 정 확하게 전사한다 (Was y l y k et al., 1980}. 이와 같이 이 유전자로부터 정확한 전사를 할 수 있다는 것이 확인되면, 제한효소를 사용하여 이 유전자의 특정 부위에 결손을 일으킨다. 그 다음 이러한 결손이 정확 한 전사에 어 떻게 영 향을 주는지 재 확인하고 분석 함으로써 pro mote r 의 위치와 영기수를 알아낼 수 있다. 즉 이러한 연구결과 /3－글로빈 유전자의 p romo t er 는 cap 부위에서 상위쪽으로 109 개의 염기쌍으로 이루어져 있다는 사실을 알게 되었다 .(Grosveld et al., 19s2 ; Dier ks et al., 1983} .

상위 p romo t er 와 요소

그림 6-5 진핵세포 유전자의 전형적인 pro mote r 부위. 여기에 TATA 상자와 세개의 p romo t er 요소가 포함된다 (Man i a ti s et al., 1987).

최근 마이어스 (M y ers, 1986) 등은 이러한 분석법을 좀더 다듬어서 생쥐의 글로빈유전자의 전사 개시 부위에서 상위에 자리하는 106 번째 영기쌍으로부터 475 번째 염기쌍에 이르는 첫번째 exon 을 분석하였 다. 우선 생쥐의 글로빈유전자를 클로운시킨 다음 이들 쿨로운된 유 전자에 시험관내에서 인위적으로 돌연변이룰 유발시켰다. 이러한 방 법으로 pro moto r 부위에만 130 개의 단일 염기치환을 일으킬 수 있었 다. 이와 갇이 처리된 유전자를 enhancer 를 포함하고 있는 풀라미드

효-_JJ

그림 6-6 생쥐 B- 글로빈 p romo t er 부위의 접돌연변아가 전사능력에 미치는 영 향. 수직선은 p romo t er 부위에 점돌연변이를 일으켰을 때의 정상에 대한 상 대적인 전사수준을 의미한다. 혹색접은 돌연변이가 발생하지 않은 누클레오 티드를 가르킨다. 아래에 있는 그립은 TATA 상자와 두 개의 p romo t er 요소 의 위치를 보여주고 있다 (Man i a ti s et a l., 1986).

에 삽입시켜 글로빈단백질을 합성하지 않는 세포에 넣어준 다음, 글 로빈 단백질이 그 세포에서 합성되는지의 여부를 검출하였다. 대부분 의 경우 5' 말단의 가장자리 부위에 돌연변이를 일으키면 이것은 글로 빈유전자의 전사에 영향을 주지 못했다. 그러나 세군데의 특별한 부 위에 점 돌연변이를 일으키면 전사가 크게 저해되는 것을 관찰할 수 있었다. 이와 같이 돌연변이에 예민한 반응을 보이는 부위 중 첫번째 것 은 Goldberg- R ogn e ss TATA 상자, 두번 째 것 은 CAAT 상위 pro mote r 그리고 세번째 것은 ca p부위에서 상위로 95 번과 87 번 사이 에 자리 하고 있는 GCCACACCC 이다. CAAT 와 TATA 상자는 여러 종류의 진핵세포 유전자의 pro mote r 에서 대단히 중요한 공통적인 염기서열로 알려져 있다 (E fs tr a ti a di s et al., 19so). 그러나 GCCACACCC 서열은 8- 글로빈유전자 의의 다른 유전자에서는 거의 찾아볼 수 없다. 사람에서 이 부위의 돌연변이로 인하여 8- 글로빈유전자의 전사가 전적으로 억제되는 경우도 찾아볼

표 6-1 프로모우터의 공통적인 염기서열

수 있는 반면 (Ork i n and Kazazia n , 1984), 전사개시부위에서 상위로 78 과 79 번째의 누클레오티드에 돌연변이가 일어나 오히려 전사가 촉 진되는 경우도 찾아볼 수 있다. 아마도 이러한 현상은 p romo t er 와 tran s 조절 단백질간의 상호작용이 촉진핀 데에서 바롯된 것으로 생 각되고 있다. (2) tran s 조절단백질과 p romo t er 의 결합 진핵세포에는 세 종류의 RNA 중합효소가 있는데, mRNA 를 전사

하는 데 필요한 효소는 RNA 중합효소 Il 이다. 그러나 RNA 중합효 소를 순수하게 추출하여 넣어주면 이 효소는 p romo t or 를 인식하지 못하기 때문에 전사 개시가 무작위적으로 일어날 뿐만 아니라 정확한 전사가 일어나지 않는다. 그러나 RNA 중합효소 n 와 핵 추출액을 함 께 넣어 주면 정확한 전사가 일어난다. 이러한 관찰로부터 RNA 중 합효소가 p romo t er 를 인식 하는 데 에는 효소와 pro mote r 이 의 에 핵 속에 있는 다른 요인이 있음을 알 수 있었다. 파커 (Parker) 와 토폴 (Topo l , 1984) 은 초파리의 핵으로부터 히스톤유전자와 액틴 유전자를 포함하는 여러 종류의 유전자 전사를 위해 필요한 조절요인 두 종류 룰 분리 하였다. 그 중 하나는 상위 p romo t er 와 결합하고, 다론 하나 는 TATA 상자와 결합한다. 지금까지 포유류에서 TATA 상자에 대 한 결 합 단 백 질 (David s on et a l., 1983 ; Shi et a l., 1986) , CAAT 상 위 p romo t er 에 대한 결합단백질, 특별히 GGGCGG p romo t or 에 대한 결합 단백질인 S p l 이 분리되었다 (Dyn anandTj i an, 1985;J on eset a l., 1987). 핵 속에는 이 의에도 DNA 와 직접 결합하지는 않을지라도 RNA 중합효소와 안정된 결합을 하는 단백질도 있다 (Zhen g e t a l., 1987). 이러한 tra ns 조절요인들은 모든 세포에서 특이성 없이 발견 되기 때문에 순차적 유전자 발현을 선택적으로 조절한다고는 할 수 없다. 그러나 이들 단백질들은 p romo t er 와 enhancer 사이에 개입되 어 특정된 유전자의 순차적 유전자 발현을 유발하는 것으로 생각되고 있다. 제한된 종류의 세포에서만 조직 특유의 유전자 발현에 관여하는 핵 단백질이 발견되었는데, 뇌하수체 전영세포에서 찾아볼 수 있는 GHF-1 이 그러한 예이다. GHF-1 은 사람의 성장 호르몬 유전자의 상위 p romo t er 에 결합한다. 이 유전자를 클로운하여 뇌하수체 이의 의 세포에 넣어 주면 이 유전자는 전사되지 않지만 뇌하수체 전영세 포에 넣어 주면 전사된다. 만약 GHF-1 를 뇌하수체 이의의 세포의 핵 추출액에 넣어 주면 성장호르몬 유전자는 전사될 수 있다 (Boder

an건 Ka ri n, 1987). 따라서 뇌하수체 전영에서 성장 호르몬 유전자가 선택적으로 발현되는 것은 조직 특유의 pro mote r 결합 단백질에 기 인하는 것으로 생각되고 있다. 3 enhancer 의 구조와 기 능 enhancer 는 pro mote r 이 외 의 또 다른 cis 조절 부위 라고 할 수 있

my el oma 세포

그림 6-7 enhancer 작용의 조직 특이성을 알아보기 위한 실험고안. m y eloma 세 포로부터 imm uno g lobul i n 의 중사슬유전자를 분리 하여 클로운시 킨 다음 VD J와 Cr exon 사이에 자리하고 있는 i n tr on 을 여러 종류의 제한효소로 절단하여 다시 imm uno g lobul in유전자를 상실한 my el oma 세포 내로 넣어 준다. 클로운된 DNA 부터 합성된 mRNA 를 전기영동으로 분리하여 nitroc ellulose p a pe r 에 blo t한 다음 제한효소를 절제한 Dr 부위를 재결합시 킨다. 이러한 실험 고안으로 Cr 메시지가 i n tr on 을 가지고 있는 DNA 에서 만 전사된다는 사실을 확인할 수 있다.

다. 처음에는 바이러스에서 발견됐으나 후에 진핵세포에서도 발견되 었다• 가장 먼저 알려진 enhancer 의 하나는 i mmuno g lobu li n 유전자 의 전사를 세포 특이적으로 조절하는 것이다. 길리스 (G illi es, 1983} 등은 쿨로운된 i mmuno g lobul i n 의 중사슬유전자를 중사슬 합성능력 을 상실한 /3-림프구 종양세포에 넣어 주면 이 m y eloma 세포는 중사 슬 합성능력을 회복한다. 그러나 만약 변아유전자와 고정유전자 사이 의 i n t ron 부위를 상실하게 되면 이 유전자의 전사는 거의 찾아볼 수 없게 된다. 즉 전사를 위해서 i n t ron 이 필요하다. 이 int r o n 속에 는 enhancer 가 존재 하는데 enhancer 에 의 해 조직 특유의 전사가 일어난다. i mmuno g lobu li n 유전자의 전사에는 반드시 enhancer 가 필요하고 class sw it ch i n g시 에 도 VD J부위 에 enhancer 가 그대로 남아 있다. 특히 enhancer 는 조직 특유의 전사와도 밀접한

(A) 생식세포에서의 irnmu nog lo bin 유전자에서는 전사가 일어나지 않음

그림 6-8 im munog lo bulin e nhancer 활성도의 모형. (A) 재배열 되기 전의 i mmuno g lobu li n 중사슬유전자. enhancer 가 J부위와 Su(sw itch 부위) 사이에 자리하고 있다. 만약 enhancer 가 없어지면 전사활 동이 급격히 감소한다. p romo t er 는 V 부위에서 상위방향에 자리하는데 enhancer 로부터는 먼 거리에 있다. (B) 재배열된 후의 imm uno g lobul i n 중 사슬유전자와 유전자의 전사. (C) class sw it ch 를 일으킨 immu nog lo bulin 유전자. class s wit ch 가 일어나는 동안 VD] 가 Cr 와 접근할 때 enhancer 는 VD] 를 따라간다.

관계를 가지고 있는데 클로운된 i mmuno g lobul i n 유전자를 B- 림프구 의의 다른 세포에 넣어주면 전사가 일어나지 않는다. 더구나. i mmuno g lobul i n 중사슬유전자의 enhancer 를 /3 듭 글로빈유전자에 삽입 시켜 주면 글로빈유전자의 전사를 m y eloma 세포에 삽입`시켰을 때보 다 100 배 정도는 촉진시킬 수 있다. (1) 발생 단계 특이 enhancer 발생단계에 따라 혹은 세포의 종류에 따라 선택적 유전자 발현을 조절하는 enhancer 가 발견되었다. 발생단계에 따라 유전자 발현의 양상을 바꾸는 가장 좋은 예는 양서류 초기 발생과정에서 나타나는 포배 전이 (midb lastu l a tra nsiti on ) 이다. 크리그 (Kr i e g)와 멜론 (Mel t on, 1987) 은 포배기에 특이하게 enhancer 가 작용하는 유전자를 발견하였 다. 이들은 이와 같은 전이 과정에 활성화되는 유전자를 쿨로운하여 이들 유전자의 5' 쪽 처음 500 개의 염기쌍에 해당하는 부위를 Xenop us fJ-글로빈 유전자에 조합시 켰다. 8- 글로빈유전자는 비 록 Xenop us 의 수정란에 주입되었다고 할지라도 발생 후기까지는 보통 전사되지 않는다. 그러나 포배 전이 시기에 활성화된 유전자에 단계 득이 enhancer 가 들어 있다면 주입 된 재조합 유전자로부터 글로빈 단 백질 합성을 기대해 볼 수 있다. North e rn blot 분석법으로 검출해 본 결과 기대했던 바와 갇이 재조합 유전자로부터 B- 글로빈유전자의 발현을 확인할 수 있었다. 포배기까지는 글로빈유전자는 전사되지 않 았다. 그러나 포배기부터 새로운 글로빈 mRNA 가 검출되기 시작하 였다. 포배 특이 유전자에 대한 결손실험을 수행해 본 결과 이 유전 자의 enhancer 는 p romo t er 에서 상류로 700 번째 염 기 쌍이 되는 부위 에 94 개의 염기쌍 배열으로 이루어져 있다. 사람의 8- 글로빈유전자 에서는 단계 특이 enhancer 가 p ol y (A) 부위에서 하위로 600 번과 900 번의 염기쌍 사이에 자리하고 있다. 만약 이러한 enhancer 부위를

사람의 r- 글로빈유전자에 삽입시키면, 8- 글로빈이 정상적으로 발현 하는 시기에 태아의 r - 글로빈유전자도 발현된다 (Trudel and Con- sta n ti ni, 1987) . (2) 조직 특이 enhancer 조직 특이 enhancer 로 발견된 가장 좋은 예는 i mmuno g lobul i n 중 사슬 유 전 자 의 enhancer 이 다. 췌 장 에 서 chym o tr yps in , amy la se, t r yp s i n 과 같은 의분비 세포의 단백 질 유전자는 내분비세포의 단백 질 인 i nsul i n 유전자의 것과는 다른 enhancer 를 가지고 있다. 이들 두 종류의 enhancer 는 모두 유전자의 5 ' 쪽 측면 부위 (flan kin g regi on ) 에 자리하고 있다. 워커 (Walker, 1983) 등은 포유류의 세포에서는 찾 아볼 수 없는 박테 리 아의 chloramp he nic o l acety lt ra nsfe r ase (CAT) 의 유전자에 ch ym o tryp s i n 과 ins ulin 유전자의 측면 부위를 조합시켜 난소 세포, 내분비 세포 및 의분비 세포에 각각 주입시킨 다음, 표시 효소인 CAT 의 활성도를 각각의 세포에서 측정 함으로써 enhancer 의 조직 특이 성 에 대 하여 알아보았다. i nsu li n 유전자나 ch ym o tryp s i n 유 전자의 인접 부위에 조합된 CAT 유전자를 각각 난소세포에 주입시켰 을 경 우 i nsul i n 유전자와 ch ym o tryp s i n 유전자의 enhancer 는 작용하 지 않았다. 그러나 내분비세포에서는 i nsul i n 유전자의 인접 부위가 CAT 유전자를 발현시킨 반면에 ch ym o tryp s i n 유전자의 인접부위는 CAT 유전자를 발현시키지 못했다. 반대로 의분비 세포에서는 ch ym o tryp s i n 유전자의 인접 부위가 CAT 유전자를 발현시키는 반면 에 i nsu li n 분바 유전자의 인접 부위는 CAT 유전자를 발현시키지 못했 다. 이러한 점으로 보아 췌장의 내분비 세포와 의분비 세포의 유전자 발현은 서로 다른 enhancer 에 의해서 조절되는 것으로 생각되었다. 동일한 단백질의 합성이 한 종류 이상의 세포에서 일어나는 경우를 초파리의 난황 단백질에서 찾아볼 수 있다. 난황 단백질의 유전자로

~토:`버JQ~ ,(J O46A8O0 00 ) 난소세.•V ` 포 •I • C C(mC(h기ho생l질lono성)rora물 aammc)ep pt hah ete nen i ci c o(o. 22l1 1B l5500 ) 7 i nsul i n•• v을 •• /• 분/ c/ 비 /. / /하 는// ~/췌 / / 장 /O 세 포

그림 6-9 췌장유전자의 enhancer 의 조직 득이성. 인슐린유전자 (I) 와 키모트립 신유전자 (C) 의 5' 말단 부위를 . 개별적으로 박테리아의 chloramp h enic o l ace ty l tr ans fe rase(CAT) 에 삽입시킨다. 또한 대조군으로서 Rous Sarcoma vi rus(V) 의 enhancer 를 CAT 유전자 옆에 삽입시킨다. 그 다음 이들 세 종 류의 클로운을 세 종류의 세포에 넣어주고 CAT 활성도를 측정한다. 그림 속에 삽입한 조그만 사진은 방사능 동위원소로 표지된 chloram phe ni col 을 기질로 사용하였을 때 생성물로 나타나는 chloramp he n ico l monoace t a t e 를 크로마토그래피로 분리하여 자기방사법으로 확인한 사진이다 (Walker et al., 1983} .

H - yp1 -'-- -H,— — J― y p 2 一 H

그립 6-10 난황단백질 유전자 전사의 조직특이성을 조절하는 두 종류의 enhancer 를 확인하는 실험고안. Hi ndlll 와 같은 제한효소를 이용하여 난황 단백질 유전자와 5 ' 부위의 요소들을 분리시킨 다음 (H i n d ll[로 분해된 부위 를 H 로 표시 함) tran spo son p - 요소에 조합시 켜 다핵 상태의 포배 (syn c yt ial blas t oderm) 에 넣어주면 초파리는 p-요소를 생식세포의 유전자에 흡수한 다. 이와 갇이 처리한 초파리를 처리하지 않은 초파리와 교배시키고, 자손 의 눈 색깔을 확인함으로써 p-요소를 받은 자손을 확인할 수 있다. 그리고 각 기관에서 yp l 과 yp 2 의 전사체의 존재여부를 조사할 수 있다.

는 YP1 과 YP 려 두 종류가 있는데 난소와 지방체에서 이들 유전자는 서로 인접해 있으면서 반대 방향으로 전사된다. YP1 과 YP2 유전자를 제 한효소를 이 용하여 분리 시 킨 다음, tra nspo sable P-element vect or 에 클로운시켜 초파리 난자의 유전자에 삽입시켰다. 또한 클로운시키 기 전에 pla smi nd DNA 를 yp유전자에 삽입시켜 이들 유전자의 생성 물을 내인성 유전자의 생성물과 구별하였다. 이들 유전자는 물론 암 컷에서만 단계 특이적으로 발현되었지만. YP2 mRNA 는 난소에서만 그리고 YP1 mRNA 는 지방체에서만 합성되었다. 이것은 난황 단백질 유전자가 5' 말단에 두 개의 enhancer 를 가지고 있으면서 하나는 난소 에서 그리고 다른 하나는 지방체에서 전사과정을 조절하는 것으로 생 각되었다. YP1 유전자의 지방체 특이 enhancer 는 ca p부위에서 상위로 196 번과 321 번의 염기쌍 사이에 자리하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 사실은 5' 측면 부위의 DNA 토막을 여 러 가지 크기로 만들어 E. col i의

(A)

그립 6-11 난황단백 질유전자의 enhancer 의 위 치 . (A) 초파리 난소에서의 ’ 박테리아의 {3-g alac t os i dase 유전자의 발현. 이 발 현은 yp 2 유전자의 상위 - 44 에서 -350 에 이르는 부위에 enhancer 를 삽입시켰 울 때 일어난다. (B) 초파리 난황단백질 유전자의 enhancer 에 대한 요약.

f]-g alac t os i dase 유전자에 조합해 줌으로써 알아낼 수 있었다. 이러한 유전자의 5’ 측면 부위 를 E. col i의 f]-g alac t os i dase 유전자에 조합시 켜 , P-elemen t에 쿨로운시 킨 다음 발생 배 에 삽입 시 켜 주었다. 이 때 P-elemen t를 받아들인 발생배에서 생긴 개체는 f]-g alac t os i dase 에 대하여 양성 반응을 보인다 (Garabed i an et al., 1986). 그러나 5 ' 인접 부위가 없는 DNA 토막을 조합시켜 주었을 경우에는 f]-ga lacto s id a se 는 지방체나 난소에서 관찰되지 않았다. 그러나 YP1 의 5’ 인접 부위 전체를 첨가하면 지방체에서는 f]-g alac t os i dase 가 합성되지만, 난소 에서는 합성되지 않는다. 이렇게 특이한 전사는 상위 321 과 196 사이 의 DNA 토막이 사용되었을 때에만 나타난다. 이와 같은 결과를 종 합해 볼 때 지방체 특이 전사는 상위 196 과 321 사이의 125 개의 영기 쌍에 의해서 조절되는 것으로 보이며, 난소 특이 전사는 YP2 유전자로 부터 상위로 44~350 염기쌍에 자리하고 있는 enhancer 에 의해서 조 절되는 것으로 보였다. (3) 호르몬 득이 enhancer 발생과정에서 대부분의 경우 유전자 발현 조절이 협동적으로 나타 난다. 협동적 유전자 발현 조절이란, 같은 시기에 한 종류의 세포에 서 여러 개의 세포 특이 단백질에 대한 유전자 발현의 유발이나 혹은 한 종류의 호르몬에 의해 여러 종류의 세포에서 여러 종류의 유전자 발현의 유발을 의미한다. 이러한 협동적 유전자 발현 조절은 여러 개 의 다른 구조 유전자들이 같거나 혹은 여러 종류의 유전자가 유사한 enhancer 에 연계되어 있을 때에만 가능하다. 췌장에서 10 종류의 의 분비 단백질에 대한 유전자의 enhancer 가 20 개의 염기로 된 consensus se q uence 를 공유하고 있음을 볼 수 있는데 , 유사한 영 기 배열이 아마도 의분비세포의 유전자를 활성화시키는 데 작용하는 것 으로 생각되고 있다.

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스테로이드 계통의 호르몬들은 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. 스테로이드 계통의 호르몬이 세포내로 들어오면 단백질 성 수용분자와 결합하여 핵 속으로 들어가 특정 부위의 DNA 와 결합 한다 (M i es fe ld et a l., 1986). 이러한 스데로이드 호르몬의 한 예는 gl ucoco rtic o idj쵸르몬인데, cort iso ne, h y drocor ti sone 과 일종의 합성 호 르 몬 인 dexameth a sone 이 glu cocortic o id 호 르 몬 에 속 한 다. g lucoco rti co icti.E..몬은 주로 단백 질 대 사를 조절하는 호르몬으로 모 든 세포에서 작용한다. me t allo thi onen 유전자와 바이러스 종양 유전 자를 포함하는 수종의 유전자는 g lucoco rti co id:호르몬에 의해 활성화 된다. 이러한 점으로 보아 호르몬 수용에 대한 DNA 의 결합부위가 이들 유전자 가까이 자리하고 있는 것으로 생각되고 있다. g lucoco rtic o i d 에 의 해 활성 화되 는 유전자의 enhancer 를 결정 하는 방 법으로 경쟁 결합법이 있다. 먼저 송아지 흉선 DNA 를 cellulose filt er 에 고정시킨 다음 방사능 동위원소로 표지된 g lucoco rti co i d 와

수용 단백질의 복합체를 넣어 준다. 이 복합체를 DNA 에 결합시키고 결합된 g lucoco rti co i d 의 방사능을 측정 한다. 그 다음 다른 종류의 DNA 를 과잉으로 넣어준 상태에서 DNA 에 결합된 복합체의 양을 측 정 한다. 만약 경 쟁 DNA 가 glu cocort ico id 수용분자 복합체 의 결합

(Ag l) uc호oc르or t몬ic에 o i d -I반pp 결I 응 합 을부 위보 V이G 는 바이러스 유제전한자효 소 •••• -HpP -VC _

그립 6-13 glu cocort ico id enhancer 의 확인 절차. (A) 생 쥐 의 유방 종양 바이 러 스의 glu cocort ico id enhancer 와 Herp e s simp lex 바이러스의 thymidine k in as 러누전자를 조합시켜 thymidine kin as e 유전자가 결핍한 세포에 넣어준 다음, g lucoco rti co i d 를 처리하여 재조합된 유전자에서 바이러스의 thymidine k in ase 가 합성되는지 여부를 조사한다. (B) glu cocort ico id 수용체와 유전자의 결합을 보여주는 glu cocort ico id enhancer 의 전자현미경사진(A. Chandler, 1983 ; B. Payv e r et al., 1983).

부위와 동일한 결합 부위를 가졌다면 경쟁 DNA 와 cellulose fi l t er 에 고정시킨 흉선 DNA 에는 방사능 동위원소로 표지한 복합체와 결합하 는 데 경쟁적이다(pfa hl, 19s2). 제한효소를 처리하여 얻은 여러 가지 DNA 토막을 이용하여 연구해 본 결과 glu cocortic o id enhancer 는 공 통적으로 TGGTACAAATGTTCT 를 가지고 있음을 알 수 있었다 (Karin e t a l., 1984} . 이 러 한 glu cocortic o id 결 합부위 의 염 기 서 열을 보 통 호르몬에 의존하지 않은 유전자에 결합시킴으로써 이러한 결합부 위의 염기서열아 enhancer 로 작용한다는 점을 알 수 있었다 (Chandler et a !., 1983} , 스데로이드 계통 호르몬에 대한 특이 enhancer 둘은 굉 장히 비슷하 기 때문에 밀접한 관계를 가지고 있는 단백질에 의해서 인식될 수 있 다. 이러한 스데로이드 계통 호르몬의 수용 단백질에는 두 개의 기능 적인 영역 즉, 호르몬에 대한 결합 영역과 enhancer DNA 에 대한 결합 영역이 있다. 이 때 첫번째 영역과 호르몬 사이의 결합은 두번 째 영역이 특이 DNA 부위와 결합하는 데 필수적이다 (Kumar et al., 1986, 1987}. 이들 단백질의 DNA 결합 영역이 대단히 유사하지만 DNA 염기서열의 작은 변화에도 민감한 반응을 보일 정도로 그 차이 를 구별한다. 예를 들면 5'-GGTCACTGTGACC - 3' 은 에스테로겐에 강하게 반응하는 enhancer 로서 에스테로겐과 수용 단백질의 결합체 룰 쉽게 결합시킨다. 그런데 이러한 염기서열에 상칭적으로 돌연변이 가 일어나서, enhancer 의 염기서 열이 5'-GG@CACTGTG d) CC-3' 이 되면 이 염기서열은 g lucoco rtic o i d 에 민감한 enhancer 로 바뀐다 (Mart ine z et a l., 1987 ; Klock et a l., 1987} . (4) Immuno g lobul in경 사슬유전자의 전사 유전자 발현의 조절에 대하여 가장 잘 연구된 경우는 생쥐의 i rnrnuno g lobul i n 유전자에 대 한 것 이 다. 이 연구에서 8- 세포 특이 전

사에 필요한 c i s- 와 t rans - 조절요인이 확인되었다. 클로운된 유전자를 국부적으로 결손시켜 염기 서열을 알아본 결과 i mmuno g lobul i n 경 사슬의 p romo t er 에는 두 개 의 중요한 부위 즉 TATA 상자와 Oc t a 상자 라고 하는 상위 p romo t er 가 있음을 알 수 있었다. (Bergm a n et a l., 1984 ; Parslow et a l., 1984) . ATTTGCAT 의 8 개의 염기 서열때문에 oc t a 상자라고 불리는 이 특별한 염기서열은 모 든 i mmuno g lobul i n 유전자의 경사슬의 p romo t er 에서 발견되었다. i mmuno g lobul i n 유전자의 중사슬 p romo t er 는 oc t a 상자가 거꾸로 뒤 집힌 염기서열 즉 ATGCAAAT 를 가지고 있다. oc t a 상자의 위치를 글로빈유전자의 상위 로 옮기 면 글로빈유전자의 전사는 11 ~ 18 개 가량 증가한다. 이러한 증가는 림프 세포에서만 관찰되었고 섬유아세포에 서는 관찰되지 않았다 (W irth et a l., 1987). i mmuno g lobul i n 유전자의 경사슬의 enhancer 염기서열은 V J배열순 서와 고정 부위 사이에 있는 첫번째 i n t ron 내에 자리하고 있다(Q ueen and Baltim ore, 1983 ; Bergm a n et a l., 1984). 이러한 enhancer 의 염기서 열을 클로운된 글로빈유전자로 옮기면 글로빈유전자 전사는 특별히 림프구에서만 일어난다 (P i card and Schaff ne r, 1984). 만약에 유전자 재배열중에 enhancer 와 p romo t er 의 위치를 근접시 키면 전사 속도가 크게 증가하는 것을 관찰할 수 있다. 림프구에서 유전자 재배열이 일어나는 동안 enhancer 와 p romo t or 가 근접하는 데, 만약 경사슬의 유전자의 재배열중에 enhancer 와 p rorno t or 의 근 접이 일어나면, 경사슬의 핵내 전사체 양이 재배열이 일어나지 않은 사슬에 비해 16,000 배나 증가한다 (Ma ther ~d Perr y, 1982). 더구나 i rnmunog lobul i n 유전자의 경사슬 enhancer 는 SV4o 바이러스 유전자 나 rne t allo t h i one i n 유전자의 p romo t er 를 촉진하는 것에 비해 자기 자신의 p romo t er 를 20 배나 더 효율적으로 촉진시킨다. 이러한 현상 은 enhancer 와 pro mote r 사이 에 일종의 특이 한 상승작용이 있는 것 으로 보인다 (Gar ci a et a l., 1986). 재배열된 i mmuno g lobul i n 유전자는

생쥐의 경사슬유전자 广oc t a 상자 ATG 로부터거의리

그림 6-14 imm unog lobul i n 유전자의 p romo t er 에 있는 oc ta상자 (Parslow et al., 1984}.

섬유아세포나 간세포에 넣어주면 활발하게 전사하지 않는 것으로 보 아 재배열 그 자체가 유전자 활성화에 충분한 조건은 아닌 것으로 생 각된다. 이러한 상승작용을 위해서는 반드시 세포 특이 tra ns 조절요 인이 있어야 할 것으로 예상된다. 1986 년 슈타우트 (S t aud t) 등에 의해서 두 종류의 pro mote r 결합요 인이 발견되었다. 슈타우트 등은 oc t a 상자를 포함하고 있는 조그만

I Pre-B I B PC I Non-B I

그립 6-15 electr o p ho retic mobil it y shi ft assay. B- 세포계통의 세포(p re-B, B, 및 혈장세포)와 비 B- 세포계통의 세포(기관지 경부세포, 섬유아세포, 적혈 구 전구세포)의 핵추출물을 8 량체 (oc t amer) 를 포함하고 있는 DNA 토막과 섞어주고 i ncuba t e 시킨 다음, 전기영동으로 분리하여, nitroc ellulose pap e r 에 blo t시켜 8 량체에 대한 상보적인 DNA( 방사능동위원소로 포지함)로 재 결합시켜 electr o p h oreti c mobil it y shift를 알아 보았다. 8 량체와 결합하지 않을 경우 DNA 토막은 빠른 속도로 이동한다. 비 B 세포계통의 세포의 핵 속에는 8 량체와 비 특이적으로 결합하는 단백질이 있기 때문에 이동속도가 저해된다. 그러나 B 세포계동의 세포의 핵 속에는 8 량체와 특이적으로 결합 하는 단백질이 있기 때문에 비특이적 결합체와는 다른 이동속도를 보인다 (St au dt et al., 1986) .

DNA 토막을 여러 종류의 세포에서 얻은 핵 추출액에 넣어 DNA 와 결합 단백질이 작용하도록 한 다음 그 생성물을 전기영동법으로 분석 하였다. 만약 핵 추출액 속에 DNA 에 결합할 수 있는 단백질이 없으 면 작은 DNA 토막은 대단히 빠른 속도로 겔을 이동해 간다. 그러나 DNA 에 단백질이 결합하면 이동 속도는 감소된다. 이러한 겔 상의 이동 속도를 분석함으로써 모든 핵 속에는 DNA 토막과 결합할 수 있 는 요인이 최소한도 한 종류 있음을 알아내었다. 그러나 B 세포 계보 에서는 oc t a 상자에 결합할 수 있는 또 하나의 요인이 발견되었다. 이 러한 단백질을 순수분리하여 확인하였는데, 특히 림프구 특이 단백질 을 NF-A2 라고 부른다. 또한 유사한 방법으로 B 세포 계보에만 제한 된 핵 단백질로서 i mmuno g lobul i n 유전자경사슬의 enhancer 에 결합 하는 단백질이 발견되었는데, NF-kB 라고 한다. 이 단백질은 성숙한 B 세포와 혈장세포(p lasma cell) 에서만 검출되었는데, 이들 세포만이 i mmuno g lobul i n 을 합성하는 것으로 알려져 있다. NF-kB 는 그의 다 론 세포에서나 im munog lo bulin 합성능력을 상실한 전구 B 세포 (pr e-B cells) 를 B 세포로 유도하면 나타나는 것을 관찰할 수 있다. i mmuno g l c,J ul i n 의 세포 특이 합성은 두 종류의 핵 단백질 즉 NF -A2 와 NF-kB 가 미리 세포 특이적으로 합성되어 준비되어 있어야만 가능하다. 아와 같이 i mmuno g lobul i n 유전자의 순차적 발현 조절에 대한 설명을 위해서는 우선 핵 단백질과 같은 조절요인이 어떻게 미 리 세포 특이적으로 합성될 수 있었는지를 설명하여야만 한다. 따라 서 NF-kB 단백질은 여러 종류의 세포 속에 불활성화된 형태로 존재 하지만 B- 계통의 세포에서 어떻게 활성화된 형태로 전환되는지 그리 고 어떻게 NF-A2 와 같은 핵 단백질 유전자가 림프구에서 순차적으 로 발현될 수 있는지에 대하여 먼저 알아야만 할 것이다. 이러한 사 실은 순차적 유전자 발현에 대한 설명이 앞으로도 얼마나 어려울 것 인가를 강하게 암시하고 있다.

(5) 메철기 첨가반응 유전자의 구조 죽 염색질의 구조를 변화시키는 또 다른 방법은 메 칠기 첨가반응 (DNA me thy la ti on) 이다. DNA 의 cyt os i ne 염기 중 5% 는 메칠기가 결합되어 있는 me t hy lc yt os i ne 의 형태로 되어 있는데, 근래 메칠기 첨가반응이 어떤 세포에서 특정된 유전자의 발현을 조절 하는데 개입될 가능성이 있다고 암시된 바 있다. 사람이나 닭의 발생 배의 적혈구 세포에서 글로빈 단백질 합성에 관여하는 DNA 에는 전 혀 메칠기가 존재하지 않으나, 글로빈을 합성하지 않는 세포에서는 동일한 유전자일지라도 메칠기가 다량 존재한다. 태아의 간세포가 헤 모글로빈을 합성하는 발생 초기에는 그 유전자에 메칠기가 전혀 첨가 되어 있지 않으나 동일한 유전자일지라도 성체 조직에서는 메칠기가 첨 가되 어 있다 (van der Ploeg and Flavell, 19so ; Groud ine and Wein - trau b, 1981}. 근래 메칠기 첨가반응과 글로빈유전자의 작용의 관계에 대해서 클로운된 글로빈유전자를 이용하여 연구된 바 있다 (Buss li n g er et al., 1983}. 태아세포의 글로빈유전자를 클로운시킨 다음 칼슘인산 에 침전시켜 세포에 넣어 주면 세포는 그 DNA 를 핵 속에까지 침투 시킨다. 일단 DNA 가 핵 속으로 들어가면 그 유전자는 전사된다. 클 로운된 글로빈유전자를 세포내로 침투시키기 전 그 유전자의 특정 부 위만을 메칠기 첨가 반응으로부터 보호하고 나머지 부위를 메칠기 첨 가 반응에 노출시킴으로써 유전자 자체는 모두 동일하나 유전자의 메 칠기 분포 양상을 다르게 만들어준 다음 각각을 전사시켰다. 전혀 메 칠기가 없는 유전자는 전사되었으나, 완전히 메칠기가 첨가된 유전자 는 전사되지 않았다. 부분적으로 메칠화된 유전자를 이용하여 실험한 결과 글로빈 유전자의 5' 부위 즉 -760 에서 +100 에 이르는 염기에 메칠기가 첨가되면 전사가 억제되는 점으로 보아 유전자의 5' 쪽에서 의 메칠기 첨가반응이 직접 유전자 발현을 조절하는 역할을 하는 것 으로 생각되었다.

(A) 『 f L 『 『 I 二二-二二二二

그림 6-16 글로빈유전자에서의 메철화현상. (A) 토끼 8- 글로빈유전자에서의 메칠화현상(f] h fJ2, f]3, {J4 ), CCGG 배열 의 위치는 ?으로 나타내었고, 메철화된 부위는 ’으로 나타내었다. (8) 클로운된 r- 글로빈유전자로부터의 전사는 메철화현상에 의해 조절된다. 꼭 대기에 있는 그림은 태아의 r- 글로빈유전자인데, 검은 부분은 exon 을 그리 고 밝은 부분은 intr on 을 나타낸다. 그 밀의 그립은 유전자내의 메칠화 부 위의 위치를 보여주고 있다. 그 다음 그립은 클로운된 글로빈을 부분적으로 혹은 천부 메칠화시킨 다음 발현에 미치는 영향을 조사한 결과이다 (Shen and Manrati s, 1980 ; Busslin g e r et al., 1983) .

기관 특이 메칠기 첨가 반응을 난알부민유전자에서 찾아볼 수 있는 데, 유전자가 수란관 세포에서는 메칠화되어 있지 않으나 다른 조직 에서는 메칠화되어 있다 (Mandel and Chambon, 1979). im munog lo bulin 합성에 있어서 class s wit c hi n g이 일어날 때 탈메칠기 반응 (deme th-

yla ti on ) 이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다 (Ro g ers and Wall, 1981). 이 경우의 탈메칠기 반응은 쥐의 림파구에서 일어나도 금속 결합 단 백질인 meta l loth ion in e I 의 생성과도 관계되는 것으로 보였다 (Comp re re and Palm iter , 1 981}. 이러한 점으로 보아 탈메칠기 반응은 조직 특유의 유전자 발현의 유발과 관계되는 것으로 보인다. 5 - azac yti d i ne 는 me t h y l t ran f erase 의 억제제로서 탈메칠기 반응을 촉 진한다 (Raz i n et a l., 1984). 만약 5 - azac yti d i ne 을 생쥐의 섬유아세포 (C3HlOT1 /2) 에 첨가해 주면 , 이들 세포들은 근세포 (m yoc yt e), 지방 세포 (ad ip oc yt e), 연골세포 (chondroc yt e) 기능으로 전환될 수 있다 (Tayl o r and Jon es, 1982 ; Konie c zny and Emerson, 1984) . 이 와 같이 세 포의 형질전환이 탈메칠기 반응으로 가능하며, 이러한 형질전환은 상 당히 안정하다. 즉 여러 차례의 세포분열을 통해서도 전환된 형질은 그대로 유지된다. 또한 5 - azac yti d i ne 을 C3Hl0Tl/2 세포에 처리하 여 얻은 근세포로부터 DNA 를 추출하여 다른 C3Hl0Tl/2 세포에 주 입하면 이들 세포들도 근세포로 전환하는 것을 확안할 수 있었다 (Lassar, et al., 1986) . DNA 메칠화가 유전자 발현의 조절과 밀접한 관계가 있음을 시사 하는 또 하나의 유력한 예는 포유류에서 X 염색체의 불활성화이다. X염 색 체 에 연관된 유전자의 하나인 hyp o xanth ine pho sph o rib o syl - tra nsfe r ase(HPRT) 유전자를 생쥐의 세포 속으로 주입시켰을 때 불 활성화된 X 염색체에 조합되면, 이 DNA 는 숙주세포에서 전사되지 않는다. 그러나 주입된 HPRT 유전자가 활성화된 X 염색체에 조합되 면 숙주세포는 HPRT 효소를 합성한다. 5-azac ytidi ne 을 불활성화된 X 염색체에 처리하면 X 염색체가 부분 적으로 다시 활성화되는 경향을 보인다. 활성화된 X 염색체를 가진 생쥐세포와 불활성화된 X 염색체를 가진 사람의 세포를 융합한 다음 이들 융합세포에 5-azac yti d i ne 을 처리해 주면 사람의 X 염색체로부 터 HPRT 효소가 합성된다 (Mohandas et a l., 1981).

X 염색체상에 연속적으로 잇달아 자리하는 효소들 (consecu ti ve enz ym es) 의 유전자는 공통적으로 5' 말단에 G-C 가 풍부한 부위를 가 지고 있다. X 염색체가 활성화된 경우에는 최소한도 세 개의 유전자 의 5' 말단이 저메철화 (h yp ome thy la t ed) 되어 있고, X 염색체가 불활성 화된 경우에는 이둘 세 개의 유전자의 5' 말단이 메칠화되어 있다 (Wolf e t a l., 1982, 1984 ; Keit h et al., 1986) , 이 와 유사하게 3' 말단의 C p G 도 활성화된 X 염색체에서보다 불활성된 X 염색체에서 훨씬 더 많이 메칠화되어 있다. 만약 이들 불활성화된 X 염색체를 자연적으로 나 혹은 인위적으로 활성화시키면, 3' 말단의 C p G 부위의 저메칠화 현 상이 두드러지게 나타난다 (Wol f et al., 1984). t era t ocarc i noma 세포가 분화하는 도중에 X- 염색체가 불활성화되면, C p G 부위의 메침화 현상 이 나타난다 (Lock et a l., 1987). 아직까지 X 염색체의 불활성화를 유도 하는 요인에 대하여 알려진 바가 없지만, DNA 메칠화에 의해 불활성 상태가 유지되고 다음 대로 전달되는 것으로 보인다 (Kaslow and Mi ge on, 1987) . 만약 탈메철기 가설이 옳다면 메칠화된 시토신의 양상이 여러 대의 세포분열을 통해서도 다음 대에 전해져야 할 뿐만 아니라 생식세포에 서는 탈메철화로 메칠기가 제거되어야 한다. 그런데 그것이 사실이 다. 일정한 양상으로 메칠화된 DNA 를 주입하면 100 회의 세포 세대 에 걸쳐 동일한 메칠화 양상이 유지된다 (W ig ler et al., 1981 ; Ste in et al., 1982). 스타인 (S t e in)은 한쪽의 사슬만이 메칠화된 DNA (he m iinet h yla te d DNA) 를 세포 내로 주입 하면 그 세포로부터 유래 된 모든 세포에서는 모든 CG 가 메칠화되는 현상을 보인다. 정자 형성 과정에서 체세포 특유의 저메칠화 양상은 나타나지 않는 다. 글로빈 난알부민, i mmuno g lobul i n 과 같은 세포 특유의 단백질에 대한 유전자들은 모두 정자 형성 과정에서는 상당한 정도로 메칠화되 어 있다. 정모세포에서 대부분의 저메칠화된 부위는 성숙한 정자에서 는 메철화된다. 정자와 난자의 유전자간의 메칠화 정도의 차이는 그

[

유전자가 모계에서 유래하였는지 혹은 부계에서 유래하였는지 판단할 수 있을 정도로 분명하다. 수컷 혹은 암컷의 원시 생식세포의 DNA 가 놀라울 정도로 메철화되지 않은 데 반하여 (Monk et a l., 1987), 정 자와 난자의 유전자는 상당히 메칠화되어 있다. 더구나 갇은 유전자 일지라도 정자와 난자 사이에 메칠화 양상에는 차이가 있다 (Re i k et

al., 1987 ; Sap ien za et al., 1987) . 이 러 한 모계 와 부계 의 메 칠화에 따른 착상(impri n ting)은 공간적 및 시간적 유전자의 발현조절에 대한 정보 를 유전적으로 부여하는 결과를 초래한다. 스웨인 (Swa i n, 1987) 등은 종양 세포 생성 유전자를 생쥐의 게놈에 삽입시킨 tra nsge ni c m ic e 를 만들었는데, 만약 이 종양 세포 생성 유 전자가 수컷으로부터 유래한 것이라면 특별히 십장세포에서만 이 유 전자가 발현되나, 암컷으로부터 유래한 것이라면 전혀 발현되지 않는 다. 유전자 발현양상이 메철화 정도와 밀접한 관계를 가지고 있다는 것이 분명하다. 죽 이 유전자는 난자형성 기간에는 메칠화되고, 정자 형성 기간에는 탈메철화된다. 이와 같이 생식세포에 따른 메칠화 양 상의 차이는 왜 포유류에서 단성생식이 불가능하며, 반드시 수컷과

그림 6-18 우선성 B-DNA 와 좌선성 Z-DNA. 메철화현상에 의해 B-DNA 가 Z-DNA 로 전환될 수 있다.

암컷의 핵의 결합을 필요로 하는지 어느 정도는 설명해 주는 것으로 생각된다. 메칠기 첨가반응과 유전자 발현의 조절과의 관계를 보여주는 또 하 나의 중요한 예 는 Z - DNA 의 존재 이 다. 대 부분의 DNA 는 Wats o n- Cr i ck 모델에 따르는 사슬의 희전방향이 우회전하는 이중나선의 B - DNA 이다. 그러나 리치 Alexander R ic h 와 그의 공동 연구자들은 특 별히 CGCGCG 와 같이 GC 의 함량이 높은 염 기 배 열을 발견했는데 이러한 회전방향이 좌회전하는 이중나선으로 되어 있다 (Wan g e t a l. , 197 9} . 이 들 좌회전하는 DNA 의 물리적인 성질은 우회전하는 대부분 의 DNA 와 대단히 다르다. 좌회전하는 DNA 는 1 회전당 12 개의 염기 쌍이 소 요되며 지그재 그 ( z ig za g) 의 모양을 형 성하는데 이 러한 DNA 를 Z - DNA 라고 한다. Z - DNA 에는 B-DNA 에서 볼 수 있는 넓은 홈 (majo r gr oove) 이 결여되어 있기 때문에 특정된 분자의 결합이 불가 능하다. 좌회전하는 Z - DNA 는 포유류와 초파리의 게놈에서 발견되 었는데, Z - DNA 에 대한 항체 를 이용하여 초파리의 다사염색체의 간 대에만 Z - DNA 가 존재함을 발견하였다 (Nordhe i m et a l., 1981}.

그림 6-19 초파리의 다사염색체내의 Z-DNA 의 위치. Z-DNA 에 대한 형광항 체가 간대에 결합하고 있다 (Nordhe i m et a l., 1981).

B-DNA 구조를 Z-DNA 구조로 전환시킬 수 있는데, 지금까지는 영류의 농도가 높은 조건에서만 이러한 전환이 가능하였다. 그러나 근래 정상적인 생리적 영류 농도에서도 GC 중합체에서 cyt os i ne 염기 에 메칠기 첨가만 이루어지면 Z - DNA 으로의 전환이 가능한 것으로 관찰되었다 (Bebe and Felsenfe ld , 1981). 더구나 누클레오솜의 간격이 영향을 주었는데, B-DNA 에서는 누클레오솜 형성이 촉 진되고 반면 에 Z-DNA 에서는 누클레오솜 형성이 억제되는 현상이 나타난다 (Ni cko l et a l., 1 982). 사실상 히스톤이 Z-DNA 에 결합되지 않은 것 은 아니다. 그러나 히스톤의 결합이 누클레오솜의 구조로 나타나지 않는 다. 죽 메칠기 첨가반응에 의해 Z - DNA 가 형성되고 이러한 DNA 의 구조에서는 누클레오솜의 형성이 전적으로 억제된다. 누클레오솜의 구조적 변화가 유전자 발현과 대단히 밀접한 관계가 있다. 전사하지 않는 DNA 에서의 누클레오솜은 덩어리로 뭉쳐 있어 서 DNAse 로 처리하여 토막을 낼지라도 서로 엉켜서 떨어지지 않는 다. 그러나 전사하고 있는 DNA 의 누클레오솜은 DNAse 에 의해 쉽 게 분해된다. 이러한 현상은 히스톤 중 특히 H 제 의해 일어나는 것 으로 생각되고 있으며, H 례 의한 엉킴이 유전자 발현을 억제하는 것으로 추측되고 있다 (W ei n tr aub 1984). 그러나 누쿨레오솜에 의한 엉컴을 풀어주면 유전자 발현이 유발되는 것으로 보였다. 누클레오솜 의 엉킴울 푸는 방법으로는 HMG 14 혹은 17 의 결합, DNAse I 에 예민한 부위형성, 히스톤의 변화, Z-DNA, 혹은 특정 염기 부위 특 유의 결합 단백질의 결합 등이 있다.

참고문헌 Behe, M. and Felsen feld , G. (1981) . Eff ec ts of meth yla ti on on a syn the ti c pol yn u cleoti de . The B-Z tra nsit ion in pol y (dG-m5dC) • pol y (dG-m5dC) . Proc. Natl. Acad. Sci . USA 78: 1619- 1 623. Bergm a n, Y., Ric e , D., Grosschedl, R. and Baltim ore, D. (1984). Two regu la to r y elements for im munog lo bulin K ligh t chain gen e exp re s- sio n . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7041- 7 045. Bodner, M . and Karin , M. (1987) . A pit떠t ary -s p ec ifi c tra ns-acti ng factor can stim ulate tra nscrip tion from the grow th hormone pro - mote r in extr a cts of nonexp re ssin g cells. Cell 50: 267-275. Busslin g e r , M ., Hurst, J. and Flavell, R.A. (1983) . DNA meth yla ti on and the regu la ti on of glo bin gen e expr e ssio n . Cell 34: 197-206. Chandler, V.L. , Maie r , B.A. and Yamamoto , K.R . (1983) . DNA sequ e nces bound spe c if ica lly by glu cocort ico id recept or in vitro render a hete r olog ou s pro mote r hormone respo n siv e in vivo . Cell 33: 489-499. Comp er e, S.J . and Palmi ter , R.D . ( 1981 ) . DNA meth yla ti on contr ol s the ind uc ibi li t y of the mouse meta l loth ion ein - 1 gen e in lym ph oid cells. C ell 25: 233-240. Davis o n, B.L., Edg ly , J .M ., Mulvi hill, E.R. and Chambon, P. (1983) . Formati on of sta b le pre in itiat i on comp le xes betw een eukary o tic class B tra nscrip tion fac to r s and pro mote r sequ e nces. Natu r e 301: 680-686. Die r ks, P., v an Ooy en , A., Chochran, M.D., Dobkin , C., Reis e r, J. and Weis sm an, C . (1983). Three regi on s ups t r e am from the cap site a re requ ire d for effi cien t and accurate tran scri ption of the rabbit

/3-glo bin gen e in mouse 3T6 cells. Cell 32: 695-706. Dy na n, W.S. and Tji an , R. (1985) . Contr o l of eukaryo t i c messeng er RNA syn the sis by sequ ence-spe c i fic DNA-bin d in g po rte i n s . Natu r e 316: 774-778. Efs t r at i ad is , A. and fou rte e n oth e r. (1980) . The str u ctu r e and evolu- tion of the human {]~g l o bin gen e fam il y. Cell 21: 653- 66 8. Garabedi an , M. J., Hung, M-C. and Wensin k , P.C. (1985) . Indepe n dent contr o l elements tha t dete r mi ne yol k pro te i n gen e exp re ssio n in alte r nati ve Drosop hi l a tiss ues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1396-1400. Garabedi an , M.J. , Sheph erd, B.M ., and Wensin k , P.C. ( 1986) . A tiss ue -spe c if ic t ra nscrip tion enhancer from the Drosop hi la yol k pro te i n 1 gen e. Cell 45: 859-867. Garcia , J.V . , Bic h -Thuy, L.T ., S ta f fo rd , J. and Qu een, C. (1986) . Syn e rgi sm betw een im munog lo bulin enhancers and pro mote r s. Natu r e 322: 383-385. Gedamu, L. and Dixo n, G.H. (1978) . Eff ec t of enzy m ati c decap ping on pro ta m i ne messeng er RNA tra nslati on in wheat- gem S-30. Bio c hem. Bio p h y s . Res. Commun. 85: 114- 12 4. Gil lies, S.D., Morriso n, S.L. , Oi, V.T. and Tonega w a, S. (1983) . A tiss ue-spe c if ic tra nscrip tion enhancer element is locate d in the majo r int r o n of a rearrang ed im munog lo bulin heavy chain gen e. Cell 33: 717-728. Grosschedl, R. and Bir n sti el, M.L. (1980) . Sp a cer DNA ups t r e am from the TATAATA sequ ence are essenti al for pro moti on of H2A his t o n e gen e tra nscri ption in viv o . Proc. Natl. Acad. Sci . USA 77: 7102-7106. Grosveld, G. C., de Boer, E., Shewmaker, C. K. and Flavell, R. A.

(1982) . DNA sequ ences necessary for the tra nscrip tion of the rabbit /3-glo vin gen e in viv o . Natu r e 295: 120-126. Groudin e , M. and Wein t r a ub, H. (1981). Ac tiva ti on of glo bin gen es durin g chic k develop m ent. Ceil 2 4: 393-401 . Jon es, K.A ., Kadonaga , J. T., Rosen feld , P.J ., Kelly, T.J . a nd Tji an , R. (1987) . A cellular DNA-bin d in g pro te i n tha t acti va te s eubar- yot ic tra nscrip tion and DNA rep lica ti on . Cell 48: 79-89. Kanto r , J.A . , T urner, P.H . and N i enh 떠 s, A.W . (1980) . /3 Thalas- semi a: Muta t i on s whic h aff ec t pro cessin g of the /3-glo bin mRNA pre cursor. Cel l 21: 149- 15 7. Karin , M ., Haslin g e r , A., Holtg rev e, H., Ric h ards, RI. , Krautn e r, P., Westp h al, H.M. and Beato , M. (1984) . Characte r iz a ti on of DNA sequ e nces thr oug h whic h cadmi um and glu cocort ico id hormones ind uce human meta l loth i o n ein - II gen e. Natu r e 308: 513-519. Kaslow, D.C. and Mi geo n, B.R. ( 1987) . DNA meth yla ti on sta b il ize s X chromosome ina cti va ti on in euth e ria n but not in marsup ial: Evi- dence for multis te p main t e n ance of mammalia n X dosage comp en sati on : Proc. Natl. Acad. Sci. U SA 84: 6210-6214. Keit h, D.H., Sin g e r sam, J. and Rig gs, A.D. (1986) . Acti ve X-chromo- some DNA is unmeth y l a te d at eig h t CCGG site s cluste r ed in a gua nin e -pl u s-cyt os in e -ric h isla nd at the 5' end of the gen ~ for pho sph o g ly c e rate kin a se. Mo!. Cell Bio l. 6: 4 122-4125. Klock, G., S tr a hle, U. and Schutz , G. (1987) . Oestr o g en and glu cocor- tico ld respo n siv e elements are closely relate d but dist in c t . Natu r e 329: 734-736. Konie c zny, S.F. and Emerson, C.P ., Jr. ( 1984) . 5-Azacyt idine ind uc- tion of sta b le mesodermal ste r n cell line age s from 10T1/2 cells: Evid e nce for regu la to r y gen es contr o llin g dete r m ina ti on . Cell 38:

791-800. Krieg , P.A. and Melto n , D.A . (1987) . An enhancer respo n sib le for acti va tin g tra nscrip tion at the mid- blastu l a tra nsiti on in Xenop u s developm ent. Proc. natl. Acad. Sci. USA 84: 2331-2335. Kumar, V., Green, S., Sta c k, G., B err y, M. , J in, J-R. and Chambon, P. (1987) . Functi on al domain s of the human estr o g en recept or . Cell 51: 941-951 . Lassar, A.B., Pate r son, B.M. and Wein t r a ub, H. (1986). Transfe c ti on of a DNA locus tha t m edia t e s the conversio n of lOTl/2 fibr oblasts int o my o blasts . Cell 47: 649-656. Lock, L. F., Takagi , N. and Martin , G.R . (1987) . Meth yla ti on of the HPRT gen e on the ina cti ve X chromosome occurs aft er chromo- some ina cti va ti on . Cell 48: 39-46. Lawn, R.M ., Efs t r a ti ad i s, A., O'Connell, C. and Man iat i s, T. (1980) . The nucleoti de sequ e nce of the human /3-glo bin gen e. Cell 21 : 647 -651. Mandel, J.L. and Chambon, P. (1979) . DNA meth y l a ti on pa tt er n within and around ovalbu min and oth e r chic k gen es. Nucleic A cid Res. 7: 2os1-2103. Ma niat is , T., Goodbourn, S. and Fis c her, J.A. (1987) . Regu la ti on of ind ucib l e and tiss ue-spe c if ic gen e exp re ssio n . Scie n ce 236: 1237 -1245. Maqu a t, L.E. , Kin nibu rgh , A.J. , Beach, L.R., Honig , G.R ., Lazerson, J., Ershler, W.B. and Ross, J. (1980) . Processin g of h uman /3-glo bin mRNA pre cursor to mRNA is defe c t ive in three pa tie n ts wit h p+ tha lassem ias . Proc. Natl. Acad. Sci . USA 77: 4287-4291 . Mart ine z, E., Giv e l, F. and Wahl, W. (1987) . An estr og e n respo nsiv e element as an ind uc ibl e enhancer: DNA sequ e nce requ i re ments a nd

conversio n to a glu cocort ico id - respo n siv e element. EMBO ]. 6: 3719-3727. Math e r, E.L. and Perry , R.P. (1982). Transcrip tion al regu la ti on of t he im rnunog lo bulin - V gen es. Nucleic Acid Res. 9: 6855-6867. McKnig h t, S. and Tji an , R.(1 986). Transcrip tion al selec tivity of v ir a l gen es in mammalia n cells. Cell 46: 795-805. Merkel, C.G ., Kwan, S. -P. and Ling r el, J.B . (1975) . Siz e of the pol y (A) regi on of newly syn the siz e d glo bin mRNA . ]. Bio l. C hem. 250: 3725-3728. Mi es fe ld , R. and seven oth e r. (1986) . Geneti c comp le menta t i on of a glu cocort ico id recept or defi ci e n cy by a cloned recep tor cDNA. Cell 46: 389-399. Mohandas, T ., Spa r kes, R.S. and Shapi ro , L.J. (1981) . Reac tiva ti on of an ina cti ve human X chromosome: Ev ide nce for X ina cti va ti on by DNA meth y l a ti on . S:i en ce 211: 393-396. Monk, M. ; B oubeli k, M. and Lehnert , S. (1987) . Temp o ral and reg ion al change s in DNA meth yla ti on in the embry on i c, extr a em- bryo n ic , and ger m celllin e ag es durin g mouse embry o develop m ent. Developm e nt 99: 371-382. My er s, R.M ., Til ly, K. and Man iat i s, T. (1 986) . Fin e stru ctu re g en etic analys i s o f a f]-glo bin pro mote r . Sci en ce 232: 613-618. Nic k ol, J., Behe, M.N. and Felsen feld , G. (19s2) . Eff ec t of the B-Z tra nsfo r mati on in pol y (dG-m5dC ) ; bip o ly (dG-m5dC ) on nucleosome form ati on . Proc. Natl. Acdd. Sci . USA 79: 1771-1775. Nokin , P., Burny, A., Huez, G. and marbaix , G. (1976) . Globin m RNA from anaemi c rabbit spl e en. Siz e of its po lya d enyl a te segm e nt. Eur. ]. Bio c hem. 68: 431-- 43 6. Nordheim , A., Pardue, M. L., Lafe r, E.M ., Moller, A., Sto l lar, B.D.

and Ric k , A. (19s1) . Anti bo die s to left ha nded Z-D NA bin d to int e r band regi on s of Drosop hi la pol yr en e chromosomes. Natu r e 294: 417-422. Orkin , S. and Kazazia n , H.H. (1984} . The muta t i on and pol ym o ph is m of the human [J-glo bin gen e and its s urroundin g DNA . Annu. Rev . Genet 18: 131- 17 1 . Parker, C.S . and Top ol , J. (1984). A Drosop hi la RNA pol ym erase II tra nscri ption fac to r contr a in s a pro mote r reg ion - sp e c if ic DNA -bin d in g acti vi ty . Cell 36: 357-369. Parslow, T.G. , Blair , D.L. , Murph y , W. J. and Granner, D .K . (1984) . Str uc tu re of the 5' ends of im munog lo bulin gen es: A novel conser- ved sequ e nce. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2650-2654. Pfa h l, M. (1982} . Spe c if ic bin d in g of the glu cocortic o id r ecep tor comp le x to the mouse mammary tum or pro v ira l pro mote r reg ion . Cell 31: 475-482. Pic ar d, D. and Schaff ne r, W . ( 1984} . A lym ph ocy te- spe c i fic e nhancer in the mouse im munog lo bulin K gen e. Natu r e 307: 80-8 2. Qu een, C. and Baltim ore, D. (1983) . Immunog lo bulin gen e tra n- scrip tion is acti va te d by downstr e am sequ e nce elements . Cel l 33 : 741-748. Rabin o w, L. and Dic k in s on, W.J. (1986) . Comp le x cisac ti ng reg ul arors and locus struc tu r e of Drosop hi la tiss ue- sp e c if ic ADH varia n t s. G e ne t ic s 112: 523-537. Razin , A., Cedar, H. and Rig gs, A. {1984) . DNA Meth y l a ti on : Bio - chemis try and Bio lo g ica l Sig n if ican ce. Spr in g e r Verlag , New York. Reik , W., Coll ick , A., Norris, M. L., Barto n , S.C. and Surani , M.A. {1987} . Genom ic im p ri n t i ng dete m i ne s meth yla ti on of pa te r nal alleles in tra nsge n i c mic e . N atu r e 328: 248-250.

Rog e rs, J . and Wall, R. (1981) . Irnmunog lo bulin heavy ch ain gen es: Demeth yla ti on accomp a nie s class swi tch i ng . Proc. N atl . A cad. Sci . USA 78: 7497- 7 501 . Rott m an, F.A., Shatk i n , A.J . and Perr y, R.P. (1974) . Sequ ences conta i n i n g meth yla te d nucleoti de s at the 5' ter m ini of messeng e r RNAs: P ossib l e im p li ca ti on s for pro cessin g . Cell 3: 197-199. Shatk i n , A .J. ( 1976) . Cap ping of euca ryo ti c rnRNAs. Cell 9: 645-653. Shein e ss, D. and Darnell, J .E . (1973) . Polya d eny lic s egm e nt in rnRNA becomes shorte r wit h age Natu r e New Bio l . 2 41: 265- 26 8. Sapi en za, C., Pete r son, A.C . , Rossant, J. and Ballin g , R. (1987) . Deg ree of meth yla ti on of tra nsge nes is dep e ndent on ga mete of orig in. Natu r e 328: 251 - 25 4 . Shen, C.K .J. and Mania t is , T. (1980) . Tis s ue-s p e ci fic DNA meth - yla ti on in a cluste r of rabbit {]- lik e glo bin gen es. P roc. natl. A cad. Sci . U SA 77: 6634- 6 638. Shi, Z .P., L ee, R. and Weir u nann, R. (1986) . Prote i n fac to r (s) bin d i ng ind epe n dentl y to tw o dif fere nt regi on s of the adenov iru s-2 majo r late pro mote r . Nucleic Acid Res. 14: 3729-3744. Sta u dt, L.M ., S in g h , H., S en, R., Wi rth, T., Sharp, P.A . and Baltim or- e, D. ( 1986) . A lym ph oid - spe cif ic pro te i n bin d i ng to the octa m er moti f of irn munog lo bulin ge nes. Natu r e 323: 640- 64 3. Ste i n , R., Gruenbaum, Y., Pollack, Y ., Razin , A . and Cedar, H . (1982) . Clonal inh erita n ce of the pa tt er n of meth yla ti on in mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 61-65. Swain , J.L . , Ste w art , T.A . and Leder, P. (1987) . Parenta l leg a cy dete r n ine s meth yla ti on and exp re ssio n of an auto s omal tran sge n e: a molecular mechan ism for pa renta l im p rint i ng . Cell 50: 719-727. Tayl o r, S.M . and Jon es, P .A. ( 1982) . Chang e s in ph enoty pic exp re s-

sio n in embryo n i c and adult cells tre ate d wit h 5-a z acy ti di n e . ]. Cel l Phys i ol . 111: 187-194. Tie m eie r , D.C ., Til g h man, S.M., Polsky, F.I. , Seid m an, J.G ., Leder, A., E dg el l, M .H. and Leder, P . (1978) . A comp ar iso n of tw o cloned mouse glo bin gen es and the ir surroundin g int e r veni ng sequ e nces. Cell 14: 237-246. Trudel, M. and Consta n ti ni, F. ( 1987) . A 3' enhancer contr i b u te s to the sta g e -spe c i fic expr e ssio n of the human /3-glo bin gen e. Gen e s and Dev. 1 : 954- 96 1 . van der Ploeg, L.H .T . and Flavell, R.D. (1980) . DNA meth y l a ti on in the human r-8-/3 glo bin locus in eryt hroi d and non-e r y thr oid cells. Cell i9: 9 47-958. Vog el i, G., Ohkubo, H., S obel, M .E. , Yamada, Y., Pasta n , I. and de Crombrugg h e, B. (1981) . Str u ctu r e of the pro mote r for chic k en type I collage n gen e. Proc. Natl . A cad. Sci. USA 78: 5334- 53 38. Walker, M .D., Edlund, T., Boulet, A.M . and Rutt er , W.J. (1983) . Cell -spe c i fic expr e ssio n contr ol led by the 5' flan kin g reg ion of the ins ulin and chym o tr ypsi n gen es. Natu r e 306: 557- 56 1 . Wang, A.H .J ., Q떠g le y, G.J. , Kolpa c k, FJ ., C raw for d, J.L., vanBoom, J.H ., v an der Marel, G. and Ric h, A. (1979) . Molecular stru ctu r e of a left -h anded double heli ca l DNA frag m e nt at ato m i c resoluti on . Natu re 282: 680-686. Wasyl y k , B., Ked ing e r , C., C orden, J., B ~·i so n, D. and Chambon, P. (1980) . Spe c i fic in vitro initiat i on of tran scrip tion on conalbumi n and ovalbw nin gen es and comp ar iso n wit h adenov iru s 2 early and late gen es. Natu re 285: 367-373. Wein t r au b, H. (1984) . Histo n e Ill-depe n dent chromati n supe r stru c- tures and the supp re ssio n of gen e act ivity. Cell 38: 17-27 .

Wi gle r, M., Levy , D. and Perucho, M. (1981) . The somati c r ep lica ti on of DNA meth y l a ti on . Cell 24: 33-40. Writh , T., Sta u dt, L . and Baltim ore, D. (1987) . An octa m er olig o nu- cleoti de ups t re am of TATA moti f is s uff icien t for lym ph oid - spe - cifi c p ro mote r acti vi ty . Natu r e 329: 174-178. Wolf. S .F., D int g is, S ., Tonio l o, D., P ersic o, G., Lunnen, K.D ., Axel- man, J. and Mig eo n, B.R. (1984) . Comp le te concordance betw een glu cose-6-ph o sph a te dehy dr og en ase acti vi t y and hyp o meth yla ti on of 3' Cp G cluste r s: Imp lica ti on for X chromosome dosage comp en - sati on . Nucleic Acid Res. 12: 9333-9348. Zheng, X- M ., Moncoll in, V., Eg ly , J.M . and Chambon, P. (1987) . A gen eral tra nscrip tion fac to r form s a sta b le comp le x wit h RNA pol ym e rase B (II) . Cell 50: 361-368.

제 7 장 RNA p rocess ing에서의 유전자 발현의 조절 유전자 발현은 DNA 로부터 RNA 가 전사되는 것으로 완성되지 않 고, RNA로 부터 단백 질이 생 성 된 후 단백 질 특유의 모양 (co nf onna­ ti on) 을 획득하거나 혹은 특유의 서열을 구현함으로써 기능적인 단백 질이 될 때 유전자 발현은 완성된다. 진핵세포에서는 유전자가 전사되면 그 전사체가 직접 해독에 쓰일 수 있는 mRNA 가 되는 것이 아니다. 전사 후에도 여러 가지 p rocess i n g을 거침으로써 드디어 단백질로 해독될 수 있는 mRNA 가 된다. 그런데 이러한 p rocess i n g도 무작위적으로 일어나는 것이 아니 고 선택적으로 일어난다. I hete r og en eous nuclear RNA 유전자가 전사되면 분자가 mRNA 보다는 훨씬 큰 nRNA 의 형태로 핵 속에 존재한다. nRNA 는 분자 크기의 변화 폭이 크고 반감기

에(h alnf-Rl i fN e)A 가 는 짧5다—. 1 9분 X 자1 03의 염크기기 는정도 m이R다N.A 가반 감보기통도 2 Xm 따RN A염 에기 서인 는반 면수 시간에 해당하는 데 비해 hnRNA 에서는 수십 분 정도에 지나지 않 는다. 성 게 란에서 mRNA 의 반감기는 5 시간인 반면에 nRNA 의 반감 기는 20 분 정도이다. nRNA 와 mRNA 의 관계가 1977 년까지도 분명치 않았으나, 그 후 cDNA 의 재결합 실험으로 일부 nRNA 는 mRNA 의 전구체임이 확인 되었다. 바스토스 (Bas t os) 와 아비브 (Av i v, 1977) 는 생쥐의 글로빈 mRNA 를 분리하여 역전사 효소를 이용하여 cDNA 를 만든 다음, cDNA 를 셀룰로스에 부착시켰다. 헤모글로빈 생성세포에 방사능 ur i d i ne 을 넣어 RNA 를 표지 한 다음, RNA 를 분리 하여 글로반 cDNA 가 부착되어 있는 셀루로스 관에 넣어 흘렸다. 글로빈을 합성 하는 RNA 는 모두 이 관에 있는 cDNA 와 결합하나, 다른 종류의 RNA 는 글로빈 cDNA 와 결합하지 않는다. 이와 같은 방법을 이용하 여 cDNA 에 결합한 RNA 를 고농도의 영류 용액으로 용출시켜 방사 능 ur idi n~ 녁i 표지된 RNA 의 크기를 측정하였다. 만약 5 분 동안만 방사능 ur idi n (0녁i 표지 하면 27S 혹은 5000 개 의 염 기 로된 RNA 에 표지된다. 이 RNA의 크기는 보통 세포질에 있는 글로빈 mRNA 보 다 거의 8 배나 더 크다. 그러나 방사능 물질 표지를 중지하고 5 분 후 에 RNA 를 추출하여 분석 하여 보면 RNA 는 15S 의 RNA 속에 들어 있고, 좀더 지나면 10S 의 세포질 글로빈 mRNA 에 들어 있는 것을 알 수 있다. 죽 hnRNA(hete r og en eous nuclear RNA) 에는 ' 글로빈 mRNA 의 전구체가 들어 있다. 분자의 크기가 엄청나게 큰 전구체인 hnRNA 가 성숙하여 실제로 단백질 합성을 지시하는 rnRNA 로 된다. 글로빈을 지시하는 15S RNA 나 혹은 10S RNA 를 추출하여 글로 빈유전자에 in situ 재 결합시켜 전자현미경으로 비교하여 보았다 (Til gh man et a l., 191sa). 15S RNA 가 결합하였을 때에는 RNA 와 DNA 간에 완전하게 결합되는 것을 볼 수 있었으나 10S RNA 와의

A

그림 7-1 생쥐 8- 글로빈유전자의 i n tr on 에 대한 전자현미경적 확인. (A) 부분적으로 변성시킨 글로빈 DNA 와 15S 글로빈 전사체의 결합, x 120,0 0 0 (해설 그립 참조) (Til g h m an et al. , 191sb). (B) 글로빈 DNA 와 글 로빈 mRNA 와의 결합. mRNA 쪽에 상보적인 영기서열의 결핍으로 재결합 되지 않음으로 DNA 에 고리가 형성된다. 이 고리가 i n tr on 에 해당한다(해 설 그림 참조)． 굵은 선은 이중 나선의 DNA, 가는 선은 단일나선의 DNA, 접선과 굵은 선을 함께 그린 것은 DNA-RNA 결합부위. X78,400 (Til gh m an et al. , 1978a) .

결합에서는 불완전한 결합으로 결합되지 못한 DNA 부분이 고리모양 울 형성하는 것을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 고리의 형성은 10S RNA 의 길이보다 글로빈유전자의 길이가 길기 때문에 나타난 것으로 해석되었다.

g글로빈i mRNA 분리

그림 7-2 글로빈 지시 서열을 포함하고 있는 핵내의 nRNA 의 분리 철차

글로빈 mRNA 에 대해서뿐만 아니 라 다른 종류의 mRNA 에 대 해 서도 전구체인 hnRNA 가 존재한다는 사실을 알 수 있었다. 즉 생쥐 배양 세포의 mRNA 전체에 대한 cDNA 를 준비하여 hnRNA 에 결합 시 켜보면 대 단히 많은 양의 cDNA 가 hnRNA 에 결합하는데, 이 러한 관찰은 핵내의 hnRNA 가 mRNA 의 전구체 임 을 보여주는 것이 라고 풀이되었다 (Hames and Perr y, 1977). 따라서 nuclear(nRNA) 에는 크게 나누어 두 종류가 있다. 즉 전체 nRNA 중 일부로서 mRNA 의 전구체 에 해 당하는 hnRNA 와 핵에만 머무는 대부분의 나머지 nRNA 이다. 이러한 사실을 알아내기 위해 서 RNA 의 다양성 즉 복잡성 (comp le xit y) 을 측정 하였다. DNA -R NA 분자 재 결 합 (molecular hyb r id iz a ti on ) 으로 RNA 의 복잡성 을 측 정할 수 있는데, 방사능 물질로 표지한 RNA 를 과량의 변성된 DNA 와 재결합시킨다. 만약 RNA 가 복잡하면 재결합 반웅 속도는 느려진 다. 즉 한 종류의 RNA 만이 존재한다고 할 때 복잡도는 1 에 해당하 는데 이러한 상황에서는 같은 영기서열을 가진 RNA 만이 존재하기 때문에 상보적 DNA 부위와의 결합이 빨리 일어난다. 그러나 동일한 양의 RNA 속에 1000 종류의 다른 염기서열이 있다면 RNA의 복잡 도는 1000 으로서 각각의 RNA 는 복잡도가 1 인 RNA 에 비해 1000 배 나 희석되어 있다고 할 수 있다. 따라서 상보적 DNA 부위와 만날 수 있는 확률이 그만큼 떨어짐과 동시에 재결합 반응 속도도 느려진다. 이와 같은 방법으로 RNA 의 복잡도를 측정해 보면 같은 세포의 mRNA 의 것 보다 nRNA 의 복잡도가 훨씬 크다는 사실을 알 수 있 다. 우선 nRNA 를 DNA 에 결합시켜 보면 nRNA 의 일부는 대단히 빠른 속도로 재결합한다. 이렇게 빠른 재결합은 nRNA 의 일부가 반 복성 DNA 로부터 전사된 것을 의미한다. 성게 포배기에 nRNA 의 25% 가량이 낮은 값의 Co t에서 DNA 와 재결합하는 반면에 mRNA 는 전혀 반복성 DNA 와 결합하지 않는다. 성게의 nRNA 에 있는 반 복성 부위의 염기수는 약 300 개의 염기로서 nRNA 의 70% 가 최소한

표 7-1 mRNA 와 nRNA 의 특징과 상대적 복잡도

도 한 개의 반복성 영기부위를 내포하고 있다 (S mith et a l., 1974). 그 러나 이와 같이 반복성 염기부위가 많은 mRNA 도 비반복성 DNA 와 재결합시키면, 완전히 반복성 부위를 제의한 재결합을 볼 수 있다. 이러한 유일성 nRNA 의 복잡도는 갇은 세포의 mRNA 의 복잡도 보 다 4~20 배 가량 높다. 이와 같은 방법으로 계산해 보면 nRNA 의 약 10~20% 가량만이 세포질 mRNA 로 성숙된다는 점을 알 수 있 다. 쥐의 간 세포에서는 단지 nRNA 의 11% 만이 mRNA 로 성숙되 고, 배양된 곤충세포에서는 5% 의 nRNA 만이 mRNA 로 성숙된다. 이러한 관찰로부터 핵 속에 존재하는 전사체 중에는 mRNA 의 전구 체가 될 수 있는 hnRNA 의 양이 적고 대 단히 빠른 속도로 tur n over 하는 nRNA 의 양은 많다는 사실을 알 수 있다. 이들 다량의 nRNA 는 mRNA 로 성숙되는 RNA 와는 다른 염기서열울 가지고 있다. 2 nRNA p rocess ing에 의한 유전자 발현의 조절 유전자의 선택적 발현은 전사과정에서는 물론 순차적인 pro cessin g 에서도 조절된다. 일단 nRNA 의 형태로 전사되지만 단백질의 아미 노산 서 열을 지시 하는 mRNA 는 선택 적 인 p rocess i n g에 의 해서 구현 된다. 물론 다량의 nRNA 중 일부분에 해당하는 hnRNA 로부터의

mRNA 생성 자체가 선택적이기도 하지만 최근 동일한 hnRNA 로부 터 발생 단계 와 세 포의 종류에 따라 mRNA 로의 p rocess i n g이 다르게 일어날 가능성이 성게와 쥐의 발생과정에서 제시되었다. 1977 년 클린 (Kleene) 과 험프리스 (Hum p hre y s) 는 포배의 DNA 로부 터 Cot의 값이 200 이 상인 유일성 DNA 를 분리 하여 포배 에 서 추출한 nRNA 와 재 결합시 켰다. 이 때 유일성 DNA의 15% 가 nRNA 와 결합 하였다. 유사한 방법으로 동일한 유일성 DNA 를 풀루티우스 유생의 nRNA 와 결합시켰을 때에도 DNA 의 15% 가 nRNA 와 결합하였다. 이때, 15% 의 DNA 재결합은 이중나선인 DNA 의 한쪽 사슬만이 재 결합에 사용되었으므로 실제로 게놈의 30% 가 nRNA 로 전사하였음

20

그림 7-3 유일성 3H-DNA 와 nRNA 의 재결합. 유일성 3H-DNA 와 포배 .RN A, RNA 혹은 포배와 플루티우스 RNA 의 혼합액을 섞어서 RNA 와 RNA 의 재결합을 유도한다 (Kleene and Hump hr eys , 1977).

울 의미한다. 즉, 게놈의 30% 가 포배와 플루티우스 유생단계에서 각

그림 7-4 플루티우스 +DNA 혹은 풀루티우스 -DNA 와 포배 및 플루티우스 RNA 와의 재결합. (A) 포배 및 플루티우스 RNA 와 플루티우스 -DNA 의 결합 정도는 같다. {B) 두 종류의 RNA 중 어떤 것도 플루티우스 -DNA 와 결합하지 않는다 (Kleene and Hump hr eys , 1977).

유생의 nRNA 의 염기서열이 동일하다면 15% 의 결합 정도가 기대되 었다. 실험결과 결합 정도는 15 % 로 나타났다. 즉 포배와 플루티우스 유생의 nRNA 는 동일한 염기서열을 가진 DNA 로부터 전사된 RNA 임을 알 수 있었다. 이러한 예상 의의 결과를 확인하기 위하여 클린과 험프리스 (1977, 1985) 는 방사능 동위원소로 표지한 유일성 DNA 를 플루티우스유생나 포배의 nRNA 에 결합시키는데 높은 Co t값에 이르기까지 재결합 반 응을 진행시켰다. 즉 상보적인 RNA 가 하나도 남김없이 모두 DNA 에 결 합할 수 있도록 재결합 반응을 연장하였다. . 그 다음 포배의 nRNA 와 결 합하지 않은 DNA (blastu la -n u ll DNA) 와 플루티우스 유생 의 nRNA 와 결 합하지 않은 DNA (plu te u s-null DNA) 를 분리 하여 blastu l a-n u ll DNA 를 plu te u s nRNA 에 결 합 시 켜 보 거 나 혹 은 plu te u s-null DNA 를 blastu l a nRNA 에 결 합시 켜 보았다. 이 들 null DNA 와 nRNA 사이에는 전혀 결합이 일어나지 않았다. 이러한 관찰 로부터 포배기에 전사된 DNA 가 풀루티우스 유생시기에 전사된 DNA 와 동일하다는 점을 확인할 수 있었다. 그러나 성게의 난소, 난 모세포, 포배, 낭배, 플루티우스 유생, 성체의 관족, 장 및 체강세포 에 존재하는 mRNA 를 비교해 보면 mRNA 는 발생단계와 조직에 따 라 다름을 알 수 있다 (Galau et a l., 1 976). 난모세포에는 게놈의 4.5 % 혹은 37 X 106~ 기쌍의 유일성 DNA 로부터 전사된 RNA 가 있다. 이 RNA 는 모두가 mRNA 는 아니지만, mRNA 의 역할을 할 수 있는 RNA 로서 한 개의 mRNA 의 평균크기를 2000 개의 염기라고 할 때, 약 18,500 종류의 mRNA 를 만들 수 있는 유전정보에 해당한다. 포배 의 mRNA 는 게놈의 3 . 1% 의 DNA 로부터 전사된 RNA 로서 13,000 종 류의 mRNA 에 해당한다. 낭배의 mRNA 는 게놈의 2% 의 DNA 로부 터 전사된 RNA 로서 8,000 종류의 mRNA 에 해당한다. 접차 발생 이 진행되면서 성체의 조직은 6000 종류의 mRNA 죽 게놈의 0.75% 에 지나지 않은 DNA 로부터 전사된 mRNA 를 포함하고 있는 것으로 밝

혀졌다. 죽, 세포질내의 mRNA 로 발현되는 게놈의 양이 점차 감소 하는 경향울 보였다. 이러한 세포질내의 mRNA 의 양적 감소가 전사 과정에서의 조절에 기인한 것인지 혹은 p rocess i n g에서의 조절에 기인한 것인지 알아보 기 위해서 월드 (Wold, 1978) 등은 포배의 mDNA 를 이용하여 DNA -RNA 재결합 실험을 수행하였다. 먼저 포배의 mRNA 를 추출한 다 음 방사능 동위원소로 표지한 DNA 에 전합시켰다. 재결합된 DNA -RNA hyb r i d 를 변성시켜 DNA 만을 분리하였는데, 이 DNA 는 포배 에 있는 mRNA 에 상보적이기 때문에 포배의 mRNA 와 재결합시켰 을 경우 상당히 특이하게 결합하였다. 이 포배 특이 DNA 는 장 (i n t es ti ne) 의 mRNA 에는 겨우 10% 밖에 결합하지 못하지만, 포배의 mRNA 에 대해서는 78% 까지 결합하였다. 월드 등은 이러한 포배 특 이 mDNA 를 이용하여 다른 조직이나 세포속에 포배 특이 mRNA 와 동일한 mRNA 가 존재하는지 그리고 있다면 어느 정도나 있는지에 대하여 알아보았다. 포배 특이 mRNA 가 세 종류의 다른조직에서도

v{frl8EipFl止버=짜 • VQV N N >NGH'c (永버)혼이H 1 0820o0 ?6o 4o 포배 m•R NA • 302 5어버비F(牛守坤[h曲90[)vm 2 0151050

그립 혹7은-5 장성의게 세b포la질st u RlaN mAD 와N의A 의재 결특합이성 (.Wo lbdl aest tua ll.a , m19D78N).A 와 blastu la mRNA

검출되었다. 즉, 낭배 및 체강세포 등에서 추출한 nRNA 에 포배 특 이 mDNA 를 재결합시켰을 때 포배특이 mDNA 의 약 80% 가 nRNA 와 재결합하는 경향을 보였다. 그러나 장의 mRNA 에 결합하는 포배 특이 mDNA 는 10% 에 지나지 않았다. 이러한 결과는 대조군 즉 포 배특이 mDNA 와 포배의 mRNA 의 재결합 정도가 75~80% 에 지나 지 않는다는 점을 감안할 때 모든 포배의 mRNA 가 장세포, 체강세 포 및 낭배세포의 세포질 속에는 거의 결여되어 있지만 이들 세포의 핵 속에는 nRNA 의 형태로 거의 동일한 정도로 존재한다는 사실을 알 수 있었다. 분화된 체강 세포나 장 세포에서 포배 특유의 RNA 를 동일하게 전사한다는 사실로부터 실제로 단계 특이적 유전자 발현은 오히려 RNA p rocess i n g에서 일어나고 있음이 시사되었다. 더구나 쥐와 생쥐를 이용한 유사한 실험에서도 뇌, 간, 신장에서 nRNA 는 거의 동일한 것으로 밝혀졌다 (C hi kara i sh i et a l., 1978}. 생 쥐의 글로빈 mRNA 에 대한 cDNA 를 이용하여 같은 동물의 간, 뇌, 배양 세포 등에서 글로빈 mRNA 의 전구체의 존재를 확인할 수

표 7-2 mRNA 와 nRNA 염기서열의 조직간 비교

B1 0 , 00

I 8���� II ���� 7-6 1���X� ��T�� p���(���8���, ��0�, �8����)��� �͜�\� nRNA X� ȴ�. (A) blas tula mDNA @� ��8���, ���8��� � ��0�X� nRNA @�X� �� ��i� (B) �(�� RNA p rocess ingD� $���XՔ� ���. P� ��X�X� 8��� ��P� ��� nRNA x� a, b, c, d, e �Ȭ����̹, 8���

� I ����� c, d, ̹et mR�NA 1����, 8���� Il ����a�, b c, t�̹ mRNA \ � ��1�� (Wold et al., 197)8 �.���� (Hum ph ries et al., 1976. )�, �t�@� �@� ���� �r F eind e ry ht-oerulemkia 8���X� nR NA ��� ����� Xenopus ����8����� � �� U�x�� ��� (Perlman et al., 1977 ; Gottes fe ld an dPar tin gt on, 9717 .) �� �� ��Lŀ��� �Ȑǔ� �� �� �ij� ����̹, t� �Ȑ�X� ���� �� �t� �Ŕ� �, ��|�, ̱, �¥� 8������L���ij

세포내에서의 바이러스 DNA 의 전사에 대한 관찰로부터 얻은 것이 다. 죽 pol yo m a 바이러스나 SV4o 바이러스는 세포에 감염되어 숙주 세포의 염색체에 조합되면 숙주세포의 DNA 가 전사할 때 함께 전사 되어 숙주세포의 핵 속에 바이러스의 RNA 가 존재한다. 이들 바이러 스 RNA 들도 숙주세포의 RNA 와 마찬가지 로 s p li c i n g을 거 쳐 성숙됨 으로써 숙주세포의 세포질 속에 바이러스 RNA 가 축적된다. 일반적 으로 분화되지 않은 t era t ocar ci noma 세포에 바이러스를 감염시킬지 라도 SV4o 와 pol yo m a 바이러스의 감염을 통한 유전자 발현은 일어 나지 않기 때문에 감영효과가 나타나지 않는다. 그러나 ter ato c ar- cino ma 세포를 분화시키면 이들 두 종류의 바이러스의 감영효과가 대단히 민감하게 일어난다. 이와 같이 분화되지 않은 ter ato c ar- cin o ma 세포에서 바이러스의 감염효과가 나타나지 않는 것은 RNA p rocess i n g의 결여에 기인하는 것으로 보였다. 즉 이것은 분화되지 않은 t era t ocar ci noma 세 포는 sv 40 의 RNA 를 s p l i ce 시 키 지 못하는 반면 분화된 세포는 s p li ce 시킬 수 있기 때문에 나타니는· 현상으로 생 각되 었다. 분화되 지 않은 ter ato c arcin o ma 세포에는 다량의 RNA 전구체가 nRNA 의 형태로 축적되어 있지만 결국 붕괴되어 버린다. 그러나 분화된 세포는 이러한 nRNA 가 세포질의 mRNA 로 성숙한다 (Seg al et a l., 1979) . 물론 유전자 발현을 위 하여 p rocess i n g을 필요로 하지 않는 바이러스는 분화되지 않은 세포나 분화된 세포 모두에서 성장할 수 있다. 이와 같이 분화된 세포에서만 s p l ici n g이 선택적으 로 가능하다는 사실은 순차적 유전자 발현이 spl icing enz ym e 의 발현 에 기인할 수도 있다는 생각을 강하게 암시하고 있다. 3 순차적 RNA pro cessin g 동일한 유전자로부터 전사된 전사체가 순차적 p rocess i n g을 거쳐 다양한 메시지의 역할을 한다. 가장 잘 연구된 순차적 RNA

p rocess i n g의 예는 B- 림프구 분화과정에서 나타나는 im munog - lobulin 죽 항체단백질 형성에 관한 것이다. 림프구의 분화과정에서 나 혹은 항원에 대한 반응으로 나타나는 전사 수준에서의 유전자 발 현은 유전자의 선택과 재배열 과정을 통하여 조절되기도 하지만 항체 유전자 발현은 RNA p rocess i n g에서도 조절된다. 일반적으로 B- 림프구는 항체 분비세포로 성숙하기 이전에 이미 이 세포가 앞으로 분비할 항체를 만들어 원형질막에 삽입시키고 있다. 여기에서 이들 항체는 일종의 항원 수용체로 작용한다. 항체 분화 단 계에 따라서나 혹은 항원에 림프구가 노출되었는지에 따라서 i rnmuno g lobul i n 은 l g M 이나 혹은 l g D 가 될 수 있다. 처음에는 모두 l g M 이 된다. 그러나 항원과 작용하여 반응을 일으킨 다음에는 lgM

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