진성 단백질의 작용을 그림 4-5 에 나타내었다. 이 그림에서 알 수 있 듯이 , 진핵 세 포의 단백 질 합성 에서 삼성 분 복합체 eIF-2 • GTP • Met- t RNA i M e t가 형성되는 초기 단계들이 원핵 세포에 있어서 삼성분 복합 체 EF-Tu • GTP • aa- t RNA 가 형성되는 초기 연장 단계와 밀접한 유 사성을 가지고 있다는 것은 매우 홍미있는 일이다• 다) mRNA- 방해작용에 대한 반대작응을 하는 인자 mRNA 는 eIF-2 에 결 합하여 eIF_2 의 3 개의 하위단위체들을 해리시킴으로써 삼성분 복합체 의 형 성 을 강력 하게 방해 한다 (Barrie u x 와 Rosenfe ld , 1978; Chaudhuri 동, 1981) . 이 러 한 방해 작용을 막는 단백 질 분획 이 A. salin a (Malath i 와 Mazurnder, 1979) , 토끼 의 망상 적 혈구에서 분리 되 었다 (Roy 등, 1981). 토끼의 망상 적혈구에서 얻은 인자는 Co-eIF-2A 와 동일한 것으로 생 각되고 있다. 라) elF-6 밀 싹 (Russel 과 Sp re mulli, 1979) 과 소의 간 추출물 (Valen-zuella 등, 1981) 에서 분리 한 분자량 23. 0~25. 0 kdal 인 이 인자는 40S

및 60S 하위단위체들의 풀을 유지하는 역할을 하는 것으로 생각되고 있 다. 이 인자는 60S 리보솜 하위단위체와 결합하여 40S 하위단위체와의 회합을 막는 항해리 인자의 역할을 하고 있다. 그러나 이미 회합되어 있는 80S 리 보솜을 해 리 시 키 는 작용은 하지 않는다 (Valenzuela, 1981) . 4.6 개시 인자들의 물리적 성질들 eIF-2 와 eIF-3 千 인자들을 제외한 다른 개시 인자들은 모두 단일 풀 리펩티드 사슬로 이루어져 있다(표 4-5 를 보라)． 그 분자량듄은 eIF-1 의 15. Okdal 에 서 eIF-5 의 150. Okdal 에 이 르기 까지 광범 하다. 토끼 의 망상 적 혈 구 에 서 얻 은 eIF-2 는 a (32~38 kdal) , {3 (48~52 kdal) , 및 r(50~57 kdal) 동 세 개의 하위 단위 체들이 1 : 1 : 1 의 화학양론적 관 계로 구성되어 있는 것으로 생각되고 있다 (Sa fe r 등, 1976; Llyo d 등, 1980) . 그러 나, Harbit z 와 Haug e (1979) 그리 고 Str i n g e r 동 (1980) 은 두 개 의 하위 단위 체 들 (분자량 48 kdal 및 38 kdal) 로 된 활동적 eIF-2 를 돼지의 간과 토끼의 망상 적혈구에서 정제하였다• 두 개의 하위단위체 로 된 eIF-2 를 다른 연 구진 에 서 도 얻 었 다 (Mi tsu i 등, 1981) . Hershty (1982) 도 두 개 의 하위 단위 체 로 된 eIF-2 를 얻 었 는데 f3 하위 단위 체 가 결핍된 것으로 생각하고 있다. 그러나, 두 하위단위체로 된 eIF-2 의 생 리적 역할에 대해서는 아칙 찰 모르고 있다. eIF-3 은 많은 폴리펩티드 하위단위체들로 구성되어 있으며 전체 분 자량은 500 kdal 이상이고 침강계수는 15S 와 18S 사이의 값을 가진다. elF-3 을 이루는 하위단위체들의 수와 그들의 화학양론적 관계는 아직 밝혀지지 않았다. 4.7 80S 개시 복합체의 조립에 관여하는 부분 반응둘 4.7.1 진핵세포의 리보솜 하위단위체 플의 생성 단백질 합성의 개시는 분리된 하위단위체들 상에서 일어나기 때문에 40S 와 60S 하위단위체들의 풀을 유지하기 위한 데카니즘, 또는 80S 러

보송들에서 이 하위단위체둘을 발생시키는 메카니즘 이 있어야 한다. 망 상 적혈구의 추출액 또는 복수 세포에서 분리한 eIF-3( 분자량 >500 kdal) 은 40S 리보솜 하위단위체들에 결합하여 40S 하위단위체들이 60S 하위 단위 체 들과 재 회 합하는 것 을 막는다. 즉, eIF-3 은 항회 합작용을 하는 것 으로 생 각되 고 있다 (Trachsel 과 Sta e helin , 1979) . 포유동물의 계 들에 서는 항회합작용을 하는 안자들의 기능에 있어서 아직 불분명한 데가 있 음에 반해 서 , 최 근 밀 싹 으로부터 항회 합작용을 하는. eIF-6 라는 작은 단 백질 (분자량 =23 kdal) 이 발견되었 는데, 이 인자는 60S 하위단위체에 결합함으로씨 이 하위단 위체가 40S 하위단위체와 재회합하는 것을 막는 戶 다는 것 이 밝혀 졌 다 (Russell 과 Sp re mulli, 1980) . 분자량이 25kdal 에 서 120kdal 되는 11 가지 풀 리 펩티 드들로 이루어지는 큰 단백질 복합체 인 밀싹의 e IF-3 은 하위단위체들의 재회합을 막거나, 80S 리보솜을 해 리 시 키 는 작용을 하지 않는다 (Checkley 등, 1981) . Checkley 둥의 결 과 와 일치하는 결과를 Valenzuel 등 (1981) 도 얻었다. 이 연구자들은 소 간 의 추출뭉에서 리보솜의 하위단위체의 재회합을 막는 활동성을 가진 분 자량 25.5 kdal 의 단일 단백질을 얻었다. 소 간에서 얻은 이 인자는 밀 싹에서 얻은 eIF-6 와 매우 바슷한 성질들을 가지고 있다. 리보솜 하위 단위체 항회합작용 또는 80S 리브송의 해리작용을 가진 그밖의 어떤 단 백질 인자가 소의 간 추출 물에 있다는 증거는 없다. 그러므로, 포유동 뭉에 있어서의 리보솜 항회합 활동성이 eIF-6 에 있을 것으로 추측할 수 있다. 고분자량의 eIF-3 에 리보솜 항회합 활동성이 있는 이유는 eIF-6 과 유사한 단백질이 eIF-3 과 회합되어 있는 데 기인될 수도 있겠지만. 아직 그러한 단백질을 eIF -3 에서 분리한 연구는 없다. 4. 7. 2 삼성분 복합체 형성 elF-2 는 GTP 의 존재 하에서 Me t-t RNA,M et와 특이하게 결합하여 삼 성 분 복합체 eIF-2 • GTP • Met- tRN A1M•' 를 형 성 한다• 이 복합체 에 서 의 GTP 와 Met- tRN A1M•t 의 몰 바 는 1 : 1 이 다 (Ranu 와 Wool, 1~76 ; Str i n - ge r 등, 1979 ; Str i n g e r 등, 1980) . GTP 의 비 가수분해 성 유사체 를 삼 성분 복합체 형성에서 GTP 대신에 쓸 수 있다. 이 사실은 삼성분 복합 체 형성에 있어서 GTP 가 하는 일은 다른자리 입체성 효과물질로서 작 용하는 것이며, 가수분해에서 발생하는 에너지를 공급하는 것이 아님을

알 수 있다 (Dett m an 과 Sta n ley, 1972) . 이 성 분 복합 재 eIF-2 • Met- tR NA1M 는 안정 하게 형 성 되 지 만 (Safe r 등, 1975) , eIF-2 와 GTP 사이 의 안정한 이성분 복합체는 형성되지 않음이 밝혀 졌다 ( Chaudhur i 등, 1981) . 그렇 지 만 elF-2 는 GTP 와는 강력 하게 결 합한다 (Walto n 과 Gil l, 1976; Str i n g er 등, 1977) . eIF-2 인자를 이 루는 3 개 의 하위 단위 체 들을 가지고 한 분석결과에 의하면 분자량 48 kdal 의 두 하위단위체들은 Me t-t RNA;M 와 mRNA 들과 결합하는 활동성을 가지고 있고, 작은 하 위단위체는 GDP 를 결합하는 활동성을 가지고 있다. 교차결합법에 의 해서도 큰 하위단위체가 Me t-t RNA1M 와 결합할 것이라는 결과를 얻었 다 (Ny ga rd 등, 1980) . 4. 7. 3 삼성분 복합체와 40S 하위단위 체와의 결합 개 시 반응의 다음 단계 는 삼성 분 복합체 eIF-2 • GTP • Met- tRN A1Mu 와 40S 리보솜 하위단위체와의 결합이다• 삼성분 복합체의 세 성분들은 모두 1 : 1 : 1 의 비로 하위단위체와 결합되어 있다 (Trachsel 과 Sta e he- lim , 1978 ; Pete r son 등, 1979) . 그러 나 삼성 분 복합체 가 40S 리 보솜 하 위단위체로 전달될 때 요구되는 목이한 조건들이 무엇인지는 아직 잘 모 르고 있다. eIF-2 와 GTP 의 존재 하에서 는 Met- tRN A1M•' 는 AUG 또 는 mRNA 가 없어도 40S 하위단위체와 결합할 수 있다. 이 결합은 eIF-3 과 eIF-1 에 의 해 서 더 안정 하게 된다 (Benne 와 Hershey, 1978; Pete r son 동, 1979) . eIF-3 와 삼성 분 복합체 eIF-2 • GTP • Met- tRN A,~!.' 는 모 두 서로의 존재에 무관하게 40S 하위단위체에 결합할 수 있으며, 서로 다른 성분의 결합을 증진시킨다. Me t-t RNA1M•’ 와 40S 하위단위체 와의 결합이 최대한으로 일어나려면 또 하나의 개시 인자 분획이 추가로 요 구될 것 이 라고 생 각하는 사람도 있다 (Maju m dar 등, 1977) . 그러 나, Maju m dar 등 (1979) 은 최 근 에 Met- tRN Ail ! et 와 40S 하위 단위 체 와의 결 합은 AUG 코돈에 의존해서 일어나는 것임을 발견하였는데 이것은 Str ing er 등 (1980) 에 의해서 확인되었다. 40S 개시 복합체 형성이 AUG 코돈 의 존성 이 라는 것은 Gup ta 등 (1975) 이 처 음으로 밝혔다.

4.7.4 mRNA 의 결합 mRNA 가 없어 도 l\tle t- tRN A1M 는 eIF-2 와 GTP 들과 함께 40S 하의 단위 체 에 결 합할 수 있다 . 이 사실은 Met- tR NA?'’ 와 40S 리 보 송 하위 단위체와의 결합은 그 다음에 일어나는 mRNA 의 결 합을 위한 필수조건 임을 암시해 준다. 이 메카니즘에 따르면, 다른 모든 개시 인자들이 존 재하더라도 Me t-t RNA1M• t가 없을 경우에는 mRNA 가 리보송에 결합할 수 없 을 것 이 다 (Darnbro11g h 등, 1973 ; Trachsel 등, 1978 ; Benne 등, 1978) . eIF-2 는 mRNA . rRNA . tR NA, 및 마이 너 스 가닥의 비 루스 RNA 들과 같은 여러 가지 RNA 들과 결합할 수 있는데, 그 중 천핵세포의 mRNA 들에 대한 천화력이 제일 크다. 그리고 eIF-2 와 mRNA 의 결합은 매우 큰 독이성을 가지고 있다. 이러한 관찰에서 eIF-2 는 mRNA 의 인식과 40S 하위단위체에의 결합에 중요한 역할을 할 것으로 믿어지지만, 아직 mRNA 의 리보솜과의 결합에서 eIF-2 가 하는 역할은 찰 모르고 있다 (Kaemp fer (1982) 의 평 론서 를 보라) . elF-3 은, 원핵세포에 있어서의 그의 상대물안 IF-3 과 마찬가지로, 자연의 mRNA 의 번역에 필수적인 인자이다. 이 인자는 ATP 와 GTP 등을 바롯한 그밖의 개시 인자들의 존재와는 무관하게 40S 하위단위체 에 결합할 수 있음이 밝혀졌다 (Benne 등, 1976; Thomp so n 등, 1977; Pete r son 등, 1979) . eIF-3 이 mRNA 의 번 역 을 촉진 시 키 는 메 카니 즘은 아직 밝혀져 있지 않지만, eIF-3 은 40S 하위단위체와 결합함으로써 mRNA 의 인식 자리와 결합 자리를 형성하는 것으로 생각되고 있다 (llan 과 llan, 1976) . 자연의 mRNA 는 광범위한 이차구조를 함유하고 있으며, 글로빈 mRNA 의 경우에는 염기들의 70% 가 염기 쌍을 이를 수 있도록 배열 되 어 있는 것으로 추산되고 있다(H older 와 Lin g rel, 1975). mRNA 의 이차구조는 큰 에너지 장벽을 가진 형태이기 때문에, 코돈들이 번역될 수 있게 노출되려면 이차구조가 풀리거나 이완되어야 한다. eIF-3 이 이 러한 풀림 과정에 관여한다는 중거가 있다(I Ian 과 Ilan, 1976). eIF-2 와 eIF-3 이 의 에 도, mRNA 의 결 합을 촉진 하는 eIF-4A, elF- 4B, 그리고 ATP 등 세 가지 인자들이 있다는 것이 알려쳐 있지만, 아

직 자세한 기능은 찰 모르고 있다. 이 인자 들 중의 어느 하나라도 빠지 면 결 합된 Met- tRN A;M•1 의 양은 전 혀 감소되 지 않지 만, mRNA 의 결 합이 상당히 감소된다. AUG 삼중체 또는 글로빈 mRNA 를 전령 RNA 로서 사용되었을 때 이 인자들은 메티오닐구 E 로마이신의 합성에는 거의 영 향을 미 치 지 않는다. 그러 나, eIF-4A, eIF-4B, 그리 고 eIF--1C 등을 단백질 합성 계에서 빼면 글로빈 합성이 상당 히 감소된다. 4. 7. 5 단백질 합성의 개시 파정에 있어서의 5' ~의 역할 진핵세포의 대부분의 mRNA 둘은 그들의 5' 끝에 갓 구조 (m 1 G ppp Xm p ) 를 가지고 있다 (3. 2. 3 절의 (가)항을 보라)． 갓 구조가 개시 반응의 효 율을 증진시킨다는 것은 많은 연구들로 확인되었다. 두 가지 실험 예 들 울 들어 보자. 갓 형성 과정이 방해된 계에서 분리한 mRNA 의 5' 꾼 에 갓 구조를 효소적으로 첨가하면 mRNA 의 리보솜 하위단위체등에 대한 친 화도가 중가한다 (Muth ukris h nan. 1978) . m1GMP. m7 GD P. 그리 고 m7Gp ppN m 등과 같은 갓 구조 유사체 들은 갓 울 가진 mR: \IA 둘의 리 보솜 에의 결합을 방해할 뿐 아니라, 세포 추출액에 있어서의 갓울 쓴 mR'.'\A 의 번역을 방해한다 (Nakash i ma 등, 1979). 이 연구결과 들은 리보솜에 갓울 쓴 mRNA 를 인식하는 특이한 자리가 있거나, eIF-2 에 갓울 쓴 mRNA 를 인식하는 특이한 자리가 있어서 그 mRNA 믈 인식한 다음에 리보솜에 결합시킬 것임을 암시해 준다. 그렇지만, eIF-2 가 mRXA 를 인식하는 데 갓 구조가 꼭 필요한 것이 아닐 것이라는 실험결 과가 있 다. 멩고비루스 RNA 또는 STNV RNA 들은 갓을 쓰지 않고 있지만 굳 로빈 mRNA 보다 더 찰 eIF-2 에 결 합한다 (Perez-Bercoff . 1982) . 5' 갓은 mRNA 의 40S 리보솜 하위단위체와의 결합을 안정시키는 것 이 그의 중요한 역할일 것으로 생각된다. 4.3.3 절의 (나)항에서 기숭 한 바와 같이, 원핵세포에 있어서는 16S rRNA 의 3' 끝 부분이 mRNA 의 AUG 코돈의 상류 쪽으로 있는 폴리푸린 부분과 염기 짝지움을 한다 는 강력한 중거둘이 있다. 진핵세포들의 mRNA 와 rRNA 들의 분석결 과는 원핵세포에 있어서의 Shin e -Dalga rno 상호작용에 견줄 만한 상보 적인 연속부분들을 찾아내지 못하였다. 최근에 Nakashim a 등 (1980) 은 광화학적 교차 결 합법 을 사용하여 갓을 쓴 mRNA 의 5' 부분과 18S rRNA 의 3' 끝 부분이 40S 및 80S 개시 복합체들에서 상호작용한다는

결과를 얻었다. 그러나 그들은 같은 신험에서 18S rRNA 가 폴리 (U) 와 도 교차 결합되는 결과룹 얻었다. 그러므로, 그들의 실험결과 만으로는 진 핵 세 포에 서 도 Shin e -Dalga r no 상호작용이 있 다고 주장하기 는 어 렵 다. 최 근에 Sarga n 등 (1982) 은 18S rRNA 의 재 로운 아 차구조 모형 을 제 안 하였는데, 3' 끝의 머리 핀 구조 바로 옆에 있는 누클레오티드들이 여러 mRNA 둘의 개 시 코돈 앞에 오는 CCACC 연 속부분과 상호작용할 것 이 라고 가정하고 있다. 더 많은 18S( 또는 12S) rRNA 둘의 3' 끝의 구조 와 진핵세포의 mRNA 의 51 끝의 구조가 밝혀지기 전에는 진핵세포에 있어서의 mRNA • rRNA 상호작용의 가능성을 평가하기는 어려울 것이 다. 박태 리 아의 16S rRNA 의 3' 끝 부근에 있는 CCUCC 연속부분과 같 은 결정적인 연속부분이 진핵세포의 18S rRNA 에서는 발견되지 않기 때문에 (표 4-2 를 보라), 만일 진핵세포에서도 Shin e -Dalga rno 상호작용 이 있다 하더 라도 18S rRNA 의 다른 어 떤 연속 부분이 관련될 것으로 생각한다. 아마도 고동생물 세포들에 있어서의 갓 구조는 원핵세포들에 서 일어나는 mRNA : rRNA 상호작용의 역할을 대신하기 위해서 진화 되었는지도 모른다. 4.7.6 갓 결합 단백질 갓 구조는 진핵세포의 mRNA 에 있어서 공동되는 특칭이며, 그의 기 능은 mRNA 의 번역의 효율울 증진시키는 것으로 확인되었다. 따라서 개시 인자들 중의 어느 하나는 갓을 쓴 mRNA 을 특이하게 인식할 것 으로 생각된다. 화학적 교차 결합법을 사용하여 실제로 그러한 단백질 이 발견되었다. 이 단백질은 토끼의 망상 적혈구의 리보솜을 씻은 액에 서 m7GDP- 세파로오스 대롱 상에서 친화 크로마토그라피로 정제되었는 데 , 그 분자량은 24kdal 이 다 (Sonnenberg 등, 1979; Sonnenberg 등, 1980). 이렇게 정제한 단백질은 HeLa 세포의 추출물에서 갓울쓴 mRNA 의 번역을 촉진시키는 기능을 가지고 있다는 것이 확인되었다. 이러한 발견과 일치하게, 갓 결합 단백질에 대한 단일군집체성 항체가 갓을 쓴 mRNA 의 번역은 방해하지만 갓울 쓰지 않은 mRNA 의 번역에는 아 무런 영 향을 주지 않는다는 것이 관찰되 었다 (Sonnenber g 등, 1981). Sonnenberg 등 (1979) 은 갓 결 합 단백 질 에 관해 서 홍미 있는 모형 을 제 안 하였다. 이 모형에 의하면, 먼저 이 단백질은 mRNA 의 전 끝에 결합하

여 단백질 • mRNA 복합체룰 형성하며, 그 다음에 이 복합체는 갓 결합 단백질의 eIF-3 에 대한 친화력에 의하여 eIF-3 을 함유하고 있는 40S 리보솜 하위단위체에 결합한다(그림 4-6 을 보라)． 안정한 복합체를 형 성한 다음에는 갓 결합 단백질은 이탈되고, elF-3 과 갓이 상호작용하

게 된다.

4갓 결합 단백 질

그림 4-6 번역의 개시 과정에 있어서의 갓과 갓 결합 단백질과의 상호 작용. 갓 결 합 단백 질 이 방출된 다음에 는 elF-3 이 갓과 상호작용한다. 4.7.7 40S 리보솜 하위단위체에 의한 진핵세포의 mRNA 의 AUG 코돈의 인식 앞의 절에서 기술한 바와 같이, 진핵세포에 있어서의 mRNA 의 인식 온 Sh ine -Dalga rno 상호작용으로 일 어 나지 않는다. Kozak (l978) 는 여 터 가지 실험결과들에 기초하여 진핵세포에 있어서의 AUG 코돈의 인식

에 대해서 〈주사 모형 ) 을 제안하였다. 최근애 수 정하 여 발 표한 새 모형 들에 대 해 서 는 Kozak (1981) , Kozak (1982) , 또는 Kozak (19 83) 등을 참 고하라. 이 가설에 의하면 40S 하위단위체는 mRNA 의 5' 끝에서 결합 한 다음에 AUG 코돈을 찾아서 이 동해 가다가 AUG 코돈에 이 르면 거 기서 멈추게 된다는 것이다(그립 4-7 을 보라)． 다시 말하면 AUG 코돈 이 40S 하위단위체에 의한 mRNA 의 인식작용의 이른바 종결 코돈이 되는 셈이다. 많은 실험결과들이 이 가설을 뒷받침해 주고 있다. 몇 가· 지 증거문 알아 보자.

단계 1 : AUG 와는 무관하게 mRNA 의 단계 2 : 40S 하위 단위 체 는 5' 말단

이 메카니즘은 40S 하위단위체가 결합하는 자리에 있는 m1G 의 촉진 효과를 합리적으로 설명할 수 있다. mRNA 의 5' 끝에 있는 갓이 시험 관 내에서의 번역을 촉진한다는 것은 이미 앞에서 기술하였다 (4.7.5. 절 을 브라). 5' 갓은 51 말단에서 수백 개의 누클레오티드 떨어진 곳에 AUG 코돈을 가진 mRNA 의 번역을 크게 증진시킨다 (Fre y ss i ne t. 1978; Frie d 동, 1981). 5' 갓이 번역을 증진시키는 것은 사실이지만 40S 하· 위단위체가 mRNA 와 결합하는 데 반드시 5' 갓이 있어야 하는 것은 아 니다 (4.7.5 절을 보라)． 또한, 51 갓은 리보솜이 어디에 결합할 것인지 를 지시하는 인식 신호는 아니다. 왜냐하면, 말단의 m i G 가 존재하든 존재하지 않든간에, 리보솜이 번역을 개시하는 자리는 언제나 5' 말단 에 가까운 AUG 코돈이기 때문이다. 따라서, 리보솜의 결합에 필요한 일차적인 인식 자리가 되는 것은 mRNA 분자의 5' 끝 그 자체이며 m7G 갓이 아닌 것으로 보인다. 따라서, 갓이 있을 경우와 없을 경우에 개시 메카니즘이 다를 것으로 생각할 수는 없다.

3.4 절에서 기술한 바와 같이, mRNA 의 구조 율 환상화시키 면 리보 솜이 결합되지 않는다(표 3-5 를 보라)． 갓을 쓰지 않은 많은 직 선형의 합성 폴리누클레오티드들은 시험관 내에서 밀싹 또는 망상 적혈구의 리 보솜과 결합하지만, 이 중합체를 RNA 연결효소로 완 상화시키면 리보 솜과의 결합능력이 상실된다. 이러한 관찰도 또한 리보솜의 전합 에 필 수적인 역할을 하는 것은 m7G 가 아니라 5' 끝 그 자체임을 층명해 주 는것이다. mRNA 가 완전한 것일 때는 그것을 광범하게 번성시켜도 내부 에 있 는 자리에는 리보솜이 결합하지 않지만, mRNA 를 여러 조각으로 가수 분해하면 mRNA 의 내부에서 유래되는 조각들에도 리보솜이 결합 한다 (F i ddes 와 Goodman, 1981). 이 실험둘로 RNA 분자 상에 있는 노출된 5' 끝이 리보솜 결합에 필요하고도 충분한 조전임 을 알 수 있다. 주사 모형이 옳다면 40S 하위단위체는 AUG 코돈이 없는 RNA 분자 물에도 결합할 수 있을 것으로 예상되는데, 실제로 그러하다는 것을 여 터 가지 합성 리 보폴리 머 들을 사용하여 증명 하였다 (Both 등 , 1976) . 주사 모형에 있어서 관건이 되는 가정은 40S 하위단위체가 5' 끝에서 첫번째 AUG 코돈까지 이동해 간다는 것이다. 여러 가지 방법들로 이 것이 중명되었냐 에데인 또는 팍타마이신 등과 같은 개시반응의 방해 물들을 첨가하거나 ITP 로 치환된 mRNA 를 주형으로 사용 함 으로써 Me t-t RNA i M et와 AUG 코돈 사이의 상호작용이 교란되었을 때, 40S 하 위단위체는 5' 끝에 가까운 AUG 를 넘어서 이동할 수 있다 (Kozak 와 Shatk i n , 1978 ; Kozal<, 1979 ; Kozak, 1980a) . 이 러 한 경 우 에 는 mRNA 는 10 개 내지 12 개의 40S 하위단위체를 가진 복합체로 축최되었 다. 아 마도 각 하위단위체는 5' 끝에 결합한 다음에 이동하고 있는 것들일 것 이다. 최근의 연구에서 밀싹의 40S 하위단위체가 이동하기 위해서는 ATP 가수분해 가 필 요하다는 것 이 밝혀 졌다 (Kozak, 1980b) . ATl? 를 제 거함으로써 이동이 방해되었을 경우에는, 단 한 개의 40S 하위단위체가 5' 끝 부근에 결합되어 있는 것을 불 수 있다. 이 실험은 주사 메카니 즘의 가장 중요한 단계를 확인하는 것이다. 여기서, 원핵세포에서는 단 백질 합성의 개시과정에서 ATP 가 전혀 필요치 않음을 상기하자. 주사 모형의 특징들 중의 하나는 5' 끝에 가까운 AUG 코돈에서 40S 하위단위체의 이동이 중지되며, 이 때 60S 하위단위체가 40S 하위단위 체와 회합한다는 것이다. 40S 하위단위체에 의한 AUG 코돈의 인식작

용의 효율은 AUG 코돈 양쪽 옆에 있는 누쿨례오티드 연속부분의 성질 에 따라서 결정되는 것으로 생각된다 . 설 NN~G 의 구조가 진핵세포 의 리보솜에 의한 개시에 가장 적합한 것 으로 생각되고 있다(표 3-3 과 표 3-4 를 보라). 이러한 연속부분이 5' 끝에 가까운 곳에 자리잡고 있 으면 그 자리에서만 개시가 일어날 것이지만, 첫번째 AUG 코돈이 덜 적합한 구조(예, GNNA—UGCu 또는 uCN NAUGG)에 들어 있다면 약간의 40S 하위단위체는 거기서 멈추어서 개시반응을 일으킬 것이고, 약간의 40S 하위단위체는 그 구조를 지나쳐서 더 하류에 있는 보다 적합한 개 시 코돈에서 개시반응을 일으키게 될 것이다. 주사 메카니즘에 있어서 의 이 특징은 홍미있는 융통성을 제공한다. 만일 첫번째 AUG 삼중체 가 준적합한 연속부분에 있으면, 약간의 리보솜은 하류에 있는 최적합 한 참재 적 AUG 삼중체 를 찾아서 이 동해 가고, 약간의 리 보솜은 준적 합한 개시 코돈에 머뭉게 될 것이므로, 한 개의 mRNA 가 두 가지 단 백질 합성에 대한 지령을 내리게 된다. 실제로 이러한 양식에 따르는 몇 가지 진핵세포의 mRNA 둘이 발견되었다. 이러한 mRNA 둘을 그림 3-6C 에서 열거하였다. 그 렇지만 진핵세포에 있어서는 이러한 이기능적 mRNA 둘은 드물게 존재한다. 대개의 경우 천 끝에 가까운 첫번째 AUG 삼중체가 있는 데가 보다 유리한, 즉 최적합한 구조를 구성하고 있다. 따라서, 정상적으로는 첫번째 AUG 코돈에서만 개시반응이 일어나며, mRNA 들은 한 가지 단백질만을 합성시키게 된다. 4. 7. 8 mRNA 결합에 있어서의 ATP 의 역할 진핵세포에 있어서의 개시반응에 ATP 가 요구된다는 것은 밀싹의 단백질 합성계에서 처음으로 밝혀졌다. ATP 를 대거나 ATP 대신에 그의 비가수분해성 유사체인 5' －아데닐릴 메틸렌 이인산 (ADPCP) 을 쓰 면 40S mRNA 의 리보송 하위단위체들과의 결합이 현처하게 감소된다 는 것이 알려졌다 (Trachsel 둥, 1977). 이 실험결과는 m Ri'.::f A 의 결합 에는 ATP 의 가수분해가 필수적이라는 것을 뒷받침해 준다 (4.7.7 절을 보라). 4.7.4 절에서 말한 바와 같이, 자연의 mRNA 는 광범위한 이차 구조를 함유하고 있으며, 번역이 일어나려면 이 이차구조가 이완되어야 한다. 이차구조의 풀립 과정은 에너지 장벽을 극복하여야 하므로 이 과 정을 촉진시키 기 위해서는 ATP 가 필요할 것이다. 풀립 과정과 관계가

있는 것으로 알려진 eIF-3 이 ATP 와 상호작용 할 것으로 기대되지만 아· 직 실험적 중거는 없다. 40S 리보솜이 mRNA 의 5' 끝에서 멀리 떨어져 있는 AUG 코돈까지 이등하는 데 ATP 가수분해에서 나오는 에너지를 이용할 것이라는 것은 4.7.7 절에서 이미 기술하였다. 4. 7. 9 80S 개시 복합체의 형성 40S 개시 복합체와 60S 리보솜 하위단위체의 결합은 80S 개시 복합체 를 형성한다. 원핵세포의 계와는 달라서, 이 회합 단계에서는 eIF-5: 라고 불리 는 특이 한 집 합 인자가 관여 한다 (Benne 등, 1978; Pete r son. 둥, 1979). 이 인자는 토끼의 망상 적혈구에서 처음으로 정제되었으며, 그 크기 는 125~160 kdal 이 고, 단일 펩 티 드 사슬임 이 밝혀 졌다. eIF-5 는 40S 개시 복합체의 형성 에는 아무 작용을 하지 않지만, 80S 복합체 의 형성에는 절대적으로 필요하다. eIF-5 로 촉 매되는 두 하위단위체의 결합반응은 GTP 의 가수분해를 필요로 한다. 5 ! －구아닐릴 메틸렌 이인 산 (GDPCP) 또는 상응하는 이미도 유도체 (GDPNP) 들과 갇온 GTP 의 비가수분해성 유사체들이 대치된 조건에서는 80S 개시 복합체가 형성되 지 않는다. 접합반응이 일어나는 동안, eIF-5 는 개시 인자 eIF-2 와 eIF-3 들이 40S 개 시 복합체 에 서 이 탈되 는 것 을 매 개 한다 (Pete r son 등, 1979a; Pete r son 등, 1979b) . 그러 나, 이 인자들의 이 탈이 60S 하위 단· 위체가 결합하기 전에 일어나는 것인지 결합과 동시적으로 일어나는 것 인지는 아직 찰 모르고 있다. 60S 리보솜 하위단위체가 없는 조건에서 는, eIF-5 는 40S 개 시 복합체 에 결 합된 Met- tRN A,M•t 의 양을 감소시 킨다. 40S 개시 복합체로부터 eIF-2 와 eIF-3 아 이탈되고 나면 Met- tRNA lMet 만을 함유하는 준안정 한 복합체 가 형 성 되 는데 , 이 복합체 가 60S 리보솜 하위단위체와 결합하여 80S 복합체를 형성하는 것으로 제안 되고있다. eIF~5 이 의 에도 두 가지 개 시 인자들, 즉, e!F -4 C 와 eIF-4D 들이 집 합반응에 관련되는 것으로 생각되고 있다. elF-4C 는 mRNA 가 결합되 지 않았을 때 Met- tRN A;M•t • 80S 복합체 의 형 성 에 부분적 으로 기 여 하 는 것으로 생각되고 있다. 또한, eIF-4C 는 60S 하위단위체와 상호작용 할 수 있도록 40S 하위단위체의 형태를 바꿈으로써 Met- tRN A/1•1 • 40S 복합체 를 안정 시 키 는 것으로 생 각되 고 있다 (Trachsel 동, 1977; Thomas

등, 1980). 왜냐하면, eIF-4D 가 메티오닐-푸로마이신 합성을 세 배나 중진시키지만 아미노아실-t RNA 와 Met- tRN Ai M c t 사이의 팹티 드 결합 형 성 에 는 필 요하지 않는 것 으로 미 루어 보아서 (Benne 와 He rshey , 1978 ; St ae heli n 둥, 1978) , eIF-4D 의 주요한 역 할은 Met- tRN Ai M cl 가 80S 개 시 복합체 상에서 올바른 위치에 자리잡게 해주는 것으로 생각할 수 있다. * 참고문현 Barrie u x, A., Rosenfe l d, M. (1978) , ]. Bi ol . Chem. 253, 6311 . Baumsta r k, B. R. , Sp r emulli, L. L. , RajB h andary , U. L . , Brown, G. M. (1977) , J. Bact. 129, 457. Benne, R. , Brown-Luedi, M. L. , Hershey, J. W. B. (1978) , J. Bio l . Chem. 253, 3070. Benne, R., Hershey, J.W .B. (1976) , Proc. Natl . Acad. Sci. 73, 3005. Benne, R., Hershey , J.W .B. (1978), J. Bi ol . Chem. 253, 3078. Benne, R., Naaktg e boren, N., Gubbens, J., Voorma, H.O. (1973). Eur J. Bi o- chem. 32, 372. Both , G.W :, Furuic h i, Y. , Muth u kris h nan, S., Shatk i n , A.J. (1976), ]. Mo/. Bi ol . 104, 637. Branlant, C., Sri W ida da, J., Krol, A., Evel,J. P . (1976), Nucleic Acid s Res. 3, 1671. Chaudhuri, A. , Str i n g e r, E. A. , Valenzuela, D. , Mait ra, U. (1981) , J. Bi ol . Che m . 256, 3988. Checkley, J.W ., Cooley, L., Ravel, J.M .•( 1981), J. Bio l. Chem. 256, 1582. Chu, J. , Mazumdar, R. (1974) , FEBS Lett . 40, 335. Clark, B.F.C . , Marcker, K.A . (1966), J. Mal. Bi ol . 17, 394. Dahlberg, A. E. , Dahlberg, J.E . (1975), Proc. Natl . Acad. Sci. 72, 2940. Darnbroug h , C. , Leg on , S. , Hunt, T. , Jac kson, R. (1973) , ]. Mo/. Bi ol . 76, 379. Das, A., Bag c hi, M., Roy , R., Ghosh-Dasti da r, P., Gup ta, N.K . (1982), Bi( )- chem. Bi op h y s . Res. Commun. 104, 89. Dasgu pta, A., Das, A., Roy, R., Ralsto n , R., Maju m dar, A., Gup ta, N.K . (1978) 讐 ]. Bio l . Chem. 253, 6054. Davis , B.D . (1971) , Meth o ds Enzym ol. 20, 248. Delk, A.S., Rabin w i ot z , J.C . (1975), Proc. Natl . Acad. Sci. 72, 528. Dott av io -M art in, D. , Sutt le, D.P., Ravel, J.M . (1979), FEBS Lett . 97, 105.

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제 5 장 단백질 합성의 연장과정 단백질 합성의 개시과정에서 mRNA 의 개시 코돈 (AUG) 과 개시 tR NA (fM et- tRN AIMC' 또는 Met- tRN A;Mc') 가 리 보솜의 작은 하위 단위 체 (30S 또는 40S) 에 결합한 다음에 리보솜의 큰 하위단위체 (50S 또는 60S) 가 집합하여 70S( 또는 80S) 개시 복합체가 형성된다. 연장과정에서는 〈연 장 회로〉라는 반복성인 과정을 거쳐서 mRNA 의 코돈들이 지시하는 대 로 한 번에 한 개의 아미노산이 첨가되면서 폴리펩티드 사슬이 형성된 다. 이러한 연장회로는 완성된 풀리펩티가 방출인자들에 의해서 리보솜 에서 떨어져 나울 메까지 진행한다. 펩티드 결합의 연장이 일어나는 동안 · mRNA 와 리보솜은 상대적인 운등울 한다. 단백질 합성의 연장과정에 있어서의 활성화된 결합 상태들의 동적인 국면에 관해서는 아직은 아는· 것이 거의 없다. 연장과정의 여러 단계들의 정적인 국면들을 그림 5-1 로 요약하였다. 매 회로에서 일어나는 일들은 아미노아실-t RNA 의 리보 솜에의 결합, 펩티 드 결합형성, 자리옮김 등이다. 결합반응에 있어서, 아미 노아실-t RNA 분자는 리 보솜에 있는 아미 노아실 자리 (A 자리) 에 결 합한다• 어떠한 아미노아실-t RKA 가 결합할 것인지는 A 자리에 있는 mRNA 의 코돈에 의해서 결정된다. 아미노아실-t RNA 의 결합은 아마 노아실_t RN A, 연장인자(원핵세포의 경우에는 EF-Tu, 또는 진핵세포의 경우에는 EF-1). 및 GTP 들르 구성되는 삼성분 복합체에 의해서 매개 된다. 아미노아실-t RNA 가 결합된 다음에는 이미 펩티딜 자리 (P 자리〉

SO S B~] 단위세 p: 자리 k 洞

예 결합하고 있는 펩티릴-t RNA 의 펩티딜 부분이 A 자리에 있는 아미 노아실-t RNA 의 아미노산에 전달되어 펩티드 결합이 형성된다. 펩티딜 기 전달효소 활동성은 리보솜의 구조 자체에 있으며 가용성 단백질 인 자를 전혀 필요로 하지 않는다. 펩티딜 기 전달반응으로 A 자리에 결 합된 새 펩티딜-t RNA 가 만들어지며, 펩티딜 기는 그의 COOH 말단에 저 아미노산 찬기가 하나 더 늘어나게 되며, P 자리에서는 펩터딜 기 의 이탈반응이 일어난다. 연장 회로의 마지막 단계인 자리옮김에서는 티보솜이 mRNA 의 5' 에서 3' 방향으로 상중체 한 개만큼 이동하게 되며, 펩티딜-t RNA 는 A 자리에서 P 자리로 이동하고 펩터딜 기를 잃

은 t RNA 는 P 자리에서 방출된다. 이와 같이 자리옮김이 끝나면 다 음에 들어 오는 아미 노아실-t RNA 를 위 한 새 코돈이 A 자리 에 나타나 게 된다. 자리옮김은 다른 또 하나의 연장인자(원핵세포의 경우에는 EF-G, 그리고 진핵세포의 경우에는 EF-2) 와 GTP 에 의해서 촉진된다 . 단백질 합성 메카니즘과 풀리펩 티드 사슬의 연장에 관한 지식은 대부 분 박테리아에서 행한 실험결과로 얻었지만 진핵세포에 있어서의 단백 질 합성 계에서도 유사한 메카니즘으로 단백질이 합성되고 있다. 그러 나, 원핵세포와 진핵세포의 단백질 합성 메카니즘에는 다른 접들이 있다. 5.1 원핵세포의 연장인자들 원핵세포의 리보솜 상에서 일어나는 폴리펩티드 사슬의 연장에는 EF- Tu, EF-Ts, 및 EF-G 동 세 가지 연장인자들이 관여한다(표 5-1) (EF- Tu 와 EF-Ts 두 인자들의 회합으로 생기는 복합체를 EF-T 라고 부른 다) . 이 인 자들은 E. coli 에 서 처 음으로 단리 되 었 지 만 (Nath a ns 와 Lip - rnann, 1961 ; Allende 등, 1964 ; Nis h iz u ka 와 Lip m ann, 1966a) , 뒤 에 Bacil lu s ste a roth e rmop hi l u s (Beaud 와 Leng yel , 1971 ; Wi ttingh ofe r 와 Lebermann, 1976) 와 Pseudomonas fiuo rescens (Lucas-Lenard 와 Beres, 1974 ; Lucas-Lenard 와 Lippm an, 1966) 등에 서 도 단리 되 었다. 한 무제 포사술 연장계에 있어서의 연장인자들은 다른 박테리아의 연장인자들로 완전히 교체될 수 있다. EF-Tu 는 세포에서 제일 풍부하게 있는 단백질이다. 그 함량은 전체 단백 질 의 5. 5 % 를 이 루고 있다 (W itting h ofe r 둥, 1979) . 그렇 지 만, 연 장인자들의 양의 바율은 성장조건에 따라서 변한다. 예를 들면 신속히 자라고 있는 세포에서의 EF-Tu : EF-Ts : EF-G 의 비는 6 : 1 : 1 이다. 이렇게 EF-Tu 의 상대적인 함량이 큰 것은 세포에 있는 t RNA 의 수준 과 밀접한 관계가 있다 (Sk j old 동, 1973; Furano, 1975). 리보솜 한 개 에 대한 연장인자들의 몰 바를 보면, EF-Ts 와 EF-G 는 생리조건의 변 화에는 관계 없이 항상 1 : 1 이다 (Gordon, 1970). 다른 한편으로, 리보 송에 대한 EF-Tu 의 비는 리보솜 한 개 당 8 내지 14 분자이다.

표 5-1 원핵세포와 진핵세 포 에 있 어서의 연장인자들 원핵세포 진핵세포 반응 EF-Tu* EF-h1 아미 노아 실 -tR N A 의 리 보 솜에 의 결합 EF-Ts* 1 EF-1,2 GDP-GTP 교 환을 촉매한 다 펩티딜 기 전달효소 펜티덜 기 전달효소 펩티드 결합의 형성, 종결 EF-G I EF- 2 자리 옮 김 1. EF-la 또는 eEF-Tu 라고도 부른다. 2*. eEEFF-T-Tus- T라s고 복도합 체부 른운다 .E F-T 라고 부른다.

5.1.l 물리적 성질 박테리아의 모든 연장인자들이 균일하게 정제되었거나 결정상태로 얻 어 졌다 (Lucas-Lenard 와 Beres, 1974) . 분자량들은 연 장인자들을 얻은 생물종에 따라서, 또 측정법에 따라서 다르지만 큰 차이는 없다. EF- Tu 의 분자량은 39 kdal 내 지 51 kdal 이 고, EF-G 는 71 kdal 내 지 85 kdal 이 다. EF-Ts 의 경 우 에 는 보고된 값들이 19 kdal 에 서 71 kdal 까지 상당한 차이 를 보이 고 있다. EF-T 의 분자량은 약 65~68 kdal 이 다. 한 분자의 EF-T 복합체 는 EF-Tu 와 EF-Ts 를 각각 한 분자 씩 함유하고 있다. 박테리아의 모든 연장인자들은 환원된 SH 기들을 함유하며, 연장인 자들의 정상적인 기능에는 SH 기들의 존재가 꼭 필요하다. EF-Tu 는 세 개의 SH 기를 함유하고 있는데, 그 중 둘만이 EF-Tu 의 기능에 중요 하다. 둘 중 하나 (SH! ）는 GTP 와 GDP 를 결합하는 데 필요하고, 다른 하나 (SH2) 는 아미노아실-t RNA 의 결합에 필요하다 (Hachmann 등, 19 71; Arai 동, 1974). ET-Ts 는 두 개의 SH 기를 함유하고 있으며, 그 중 하나는 EF-Tu•EF-Ts 복합체 형성 에 꼭 필요하다. EF-G 는 4 내지 6 개의 SH 기를 가지고 있으며, 그 중 하나는 구아닌 누클레오티드를 결 합하는 데 꼭 필요하다 (Marsh 등, 1975; Rohrbach 와 Bodley, 1976) . 5.1.2 EF-Tu 의 기능 EF-Tu 는 삼성분 복합체 아미노아실-t RNA·EF-Tu•GTP 의 형성을

거쳐서 아미노아 실 -t R NA 가 70S 리보솜에 결합하는 것을 증진시 킨다. 결합이 일어난 다음에 GTP 가 가수 분해되고 , 리보솜으로 부터 EF-Tu· GDP 가 방 출된 다(그림 5-2 를 보라). 가) EF-Tu 와 구아닌 누클레오티드를 합유하는 복합체둘의 형성 EF-Tu- c GDP, GTP, GMP-P (CH2 ) 2P, GMP-P (NH) P 들과 같은 구아닌 누쿨레 오티 드 들과 결 합 한다. EF-Tu 는 GDP 와 결 합하며 (20° C, 10 mM Mg H , pH 8 에서 Kd = 4 nM), 갇온 조건에서 GTP 와도 결합하지만 친화력 은 좀 작 다 (/(d = 0. 3 µM) (M ille r 와 \Veis s bach, 1970) . Mg 2+ 은 EF-

AA-tR ~AA-tR NA-T u-G TP

Tu·GDP 복합체의 안정 에 꼭 필요하다. Mg 2+ 이 없을 때의 Kd 값는 8 µM 이다. EF-Tu 의 한 분자 당 한 분자의 구아닌 누클레오티드가 결 합한다. EF-Tu-GTP 와 EF-Tu•GDP 사이에는 형태의 차이가 있움이 밝혀졌 다. EF-Tu 의 SH2 기의 반응성은 EF-Tu•GDP 에 있어서보다는 EF-Tu•GTP 에 있어서 더 크다 (EF-Tu 의 SH2 기는 아미노아실-t RNA 와 결합하는 작용기임울 상기하라). 나) EF-Tu·GTP· 아미노아실-t RNA 복합체의 형성 EF-Tu 는 연장 아미 노아실-t RNA 와 GTP 와 함께 삼성분 복합체를 형성한다 (Skoul t ch i 등, 1968; Ravel 등, 1968; Shorey 등, 1969; Weis s bach 등, 1969; Coop er 와 Gordon, 1969). 이 복합체 에 있어서 성분들의 몰 비는 1 : 1 : 1 이다. N- 아세틸아미노아실-t RNA 둘, 또는 포르밀 -Me t-t RNA0 1 , 또는 탈아 실화된 t RNA 들과 같이 NH2 기가 가리어진 t RNA 둘은 안정한 삼성분 복합체 형성 에 관여할 수 없는 것으로 미루어 보아서, EF-Tu 와 아미

노아실-t RNA 들과의 상호작용에는 변형되지 않은 아미노아 실 잔기의 존재 가 필 수적 인 것 으로 생 각된 다 (Ono 등, 1968 ; Weis s bach 등, 197 1 ; Lockwood 등, 1971) . 그렇 지 만, EF-Tu 는 a- 히 드 록 시 아미 노산 을 지 닌 t RNA 와의 삼성분 복합체를 형성할 수 있으며 그 것 이 리보송에 결 합하는 것을 중진시킨다 (Fahnens t ock 둥, 1972). tR NA 분자 의 CCA 끝 이 손상되지 않은 상태로 있는 것도 상성분 복합체 형성에 중요한 것으 로 밝혀져 있다. 아미노아실-t RNA 의 3' 말단에 CCA 연속부분을 가진 2' (3')-0- 아미 노아실 울리 고누클레 오티 드들은 EF-Tu • GTP 복합체 와 상 호작용한다 (R i n g er 와 Chladek, 1975). 다론 한편으로는, 효모의 tR NNh• 의 3' 말단의 리보오스를 2’ 과 3' 탄소 원자들 사이에서 분열시킨 것 , E. coli 의 tR NAV•I 의 5' 반분자를 제 거 한 것 , 또는 말단의 CCA 연 속 부분에 시티단 찬기를 하나 더 붙인 것 둥은 복합체의 형성을 방해한다 (Chen 과 Of en g a nd, 1970 ; Of en g a nd 와 Chen, 1972 ; Krauskop f 등, 1972; Thang 등, 1972). 역코돈 부분을 포함하여, tR NA 분자의 다른 부분에 있어서의 변형들은 복합체 형성에 영향을 미치지 않는다. 이러 한 사실에서, t RNA 의 역코돈 고리는 EF-Tu 와의 상호작용에는 직접 관계되지 않으며, 자유롭게 노출되어 있어서 리보솜의 A 자리에 있는 mRNA 의 해당하는 코돈에 의해서 인식될 수 있는 것으로 보인다. 삼성분 복합체의 형성은 이성분 복합체 EF-Tu•GTP 를 거쳐서 진행 한다. EF-Tu 는 GTP 를 가진 이성분 복합체에서만 삼성분 복합 체를 형성할 수 있는 적절한 형태를 가지고 있는 것으로 보인다. 왜냐하면 EF-Tu·GDP 는 아미노아실_t RNA 와 상호작용하지 않는다. EF-Tu 의 제 2 의 반응성 SH 기 (SH 시 가 아미 노아실-t RNA 를 결 합하는 데 관여 한 다. SH2 와 득이 하게 반응하는 L-1- 토실 아미 도 -2- 페 닐 에 틸 클로로메 틸 케돈은 EF-Tu 의 구아닌 누클레오티와의 상호작용에는 영향을 미치자 않지 만 EF-Tu 의 아미 노아실-t RNA 와의 상호작용을 방해 한다. 5. 1. 3 EF-Ts 의 기능 앞의 절 에서 언급한 바와 같이 , EF-Tu 는 GTP 보다는 GDP 에 대 한 친화력이 더 크지만, EF-Tu·GDP 복합체의 형태에서는 아미노아실 -tRN A 와만 상호작용할 수 있다. EF-Ts 의 기 능은 EF-Ts-EF-Tu 를 중간물질로 형성시키면서 EF-Tu·GDP 로부터 EF-Tu•GTP 를 재생시

키 는 것 이 다 (Weis s bach 등, 1970) . 또 한편으로는, 자유 EF-Tu 가 GTP 를 결합할 때는 EF-Ts 가 필요하지 않다. EF-Ts 는 EF-Tu•GDP ' 의 GDP 와 자유 GDP 또는 GTP 사이 의 교환반응을 촉진 시 킨 다 (Mi ller 와 Weis s bach, 1970) . EF-Tu 에 대 한 EF-Ts 와 GDP 의 친 화도는 거 의 비 숫하다. EF-Tu • EF-Ts 와 EF-Tu· GDP 의 해 리 상수는 각각 2 nM 과 3 nM 이 다. 그 러 므로, EF-Ts· EF-Tu 복합체 가 형 성 될 수 있다. EF- Ts 가 EF-Tu·GDP 로부터의 삼성분 복합체의 형성은 촉진시키지만, EF-Tu •G TP 또는 자유 EF-Tu 로부터 의 삼성 분 복합체 의 형 성 을 촉진 하지 않는다는 사 실 은 EF-Ts 의 기능 이 EF-Tu·GTP 의 재생을 일으키 는 것 임 을 뒷 받침 해 준다 (Wate r son 둥, 1970) . 5.1 .4 EF-G 의 기능 EF-G 는 리보솜이 존재하는 조건에서 GTP 를 신속히 가수분해하여 GDP 와 Pi 를 생 성 시 킨 다 (Ni sh iz u ka 와 Lip m ann, 1966b) . 이 반응은 리 보솜이 없는 조건에서는 일어나지 않는다. 폴리 (U) 와 아미노아실-t RNA 들은 EF-G 의 촌적 으로 일어 나는 리 보송의 GTPase 활동성 을 촉진한다. 시 험 관 내 에 서 의 연 구에 의 하면, 펩 티 딜-t RNA 가 70S 리 보솜의 A 자라 에서 P 자리로 이동하기 위해서는 EF-G 와 GTP 가 필요함이 밝혀졌 다. 삼성분 복합체 EF-G 러보솜 .GTP 는 GTPase 활동성에 있어서 중 간체의 역할울 한다. 리보솜의 50S 하위단위체는 GTP 의 가수분해를 부­ 분걱으로밖에 뒷받침하지 않으며, 30S 하위단위체는 아무런 작용을 하­ 지 않는다. 30S 하위단위체는 아마도 EF-G·GDP 복합체로부터 GDP 를 쉽게 방출되게 하는 역할을 하는 것으로 생각된다. 리보솜 상에서 GTP 가 가수분해된 다음에는 삼성분 복합체 EF-G· 리보솜 ·GDP 가 형성된다. 이 복합체 와 푸시 드산과 작용하면 이 복합체 가 안정 해 진다 (Bodley 동, 1969 ; Bodley 등, 1970) . 푸시드산은 단백질 합성을 방해하는 스테로이드 항생제이다. 이 항생 제는 EF-G 에 의해서 촉매되는 GTPase 의 작용울 방해한다 (Pes t ka, 1!) 68; Tanaka 둥, 1968) . 푸시 드산이 방해 하는 표적 물은 EF-G 이 지 라 보솜 단백질이 아니라는 것은 이 항생제에 대한 저항성을 가진 돌연변 이체를 얻음으로써 확인되었다. 야생형 세포에서 얻은 EF-G 는 푸시~ 산에 민감하지만, 돌연변이체에서 얻은 EF-G 는 저항성을 가지고 있다`

푸시 드산이 GTP 의 가수분해 를 방해 하는 작용을 자세 히 분석 해 보면 EF-G·GDP 복합체 물 리 보솜 상에 안정 하게 묶어 놓 기 때 문이 라는 것을 알 수 있다 (Mondolell 등, 1971a ; Mondolell 동, 1971b) . EF-G 가 리 보 솜 상에 묶여 있 게 되면 촉 매로서의 작용이 본 질 적 으로 방 해된 다 . EF-G·GDP 복합체가 리보송에 묶이기 때문에, 푸시드산은 자리 옮김 과 GTP 의 가수분해륭 한 차례씩만 일어나게 하고 더 이상 일어 나지 못하게 한 다. 삼성분 복합체가 형성되고 그 다음에 푸시드산이 반응하는 것을 아 래의 식으로 나타내었다. 1. EF-G + GTP (GDPCP) +± EF-G •G TP (GDPCP) 2. EF-G •G TP (GDPCP) +± EF-G-50 S •G TP 또는 EF-G •S OS • GDPCP 3. EF-G •5 0S • GTP ➔ EF-G •S OS • GDP + Pi 4. EF-G·50S·GDP ~푸시드산 EF-G·50S·GDP • 푸시드산 EF-G·GTP 복합체는 매우 불안정하므로 존재하지 않지만 GTP 의 유사 체 GDPCP 와의 복합체 EF-G·GDPCP 는 존재한다. 또한, 진핵세포의 EF-2 는 GTP 와 안정한 복합체를 형성한다 (5.4.1 절을 보라). EF-G· .50 S·GTP 복합체는 형성되자마자 EF-G-50S·GDP 로 가수분해되므로 단리할 수 없다• 그러나 EF-G-50S·GDPCP 는 안정하게 형성되므로 단 리할 수 있다. 푸시드산이 작용하는 메카니즘을 고려하면, 성장하고 있는 세포는 푸 시드산이 있는 데에서는 리보솜의 P 자리에 펩 티덜-t RNA 가 축지할 것 이라는 것을 예견할 수 있다. Bacil l us nze g a t er i tt m 의 원형전체 윤 푸시 드산으로 처리하면 단백질 합성이 즉시 중지되며, 푸로마이신에 의해서 갓 생긴 풀리펩티드 사슬의 약 80% 가 방출된다. 이것 은 단 백질 합성이 자리옮김이 일어난 다음에 중지되었다는 것을 증명해 준다 ( Ce l ma 등, 1972; Cundliff e, 1972) . 그러 므로, 푸시 드산은 자리 옮김 에 칙 접 적 으로 작용하는 방해물이 아니라 기능을 가진 아미노아실-t RNA 가 리보솜에 결합하는 것을 방해함으로써 단백질 합성을 방해한다는 결 론을 내릴 수 있다. 이것은 또한 EF-G·GDP • 리보솜 • 푸시드산 복합체가 EF-Tu 의 존적으로 일어나는 아미노아실-t RNA 의 리보송에의 결합을 방해하는 것 으로도 증명 된다 (Carber 등, 1972; Mi ller , 1972 ; Ric h man 과 Bodley, 1972). 이 결과는 EF-G 와 EF-Tu 가 리보솜 상에서 공통되는 자리 또

는 중첩하는 자리 에 결 합 한다는 것을 암시하며, 한 인자가 안정한 결합 을 이루게 되면 다른 인자가 리보솜과 상호작용하는 것이 방지됨으로써 이 인자가 일으키는 반응이 방해된다는 것을 암시한다. 50S 하위단위체와 바가역적으로 결합하는 항생제 티오스트 캡톤 과 시 오마이 신은 유사한 구조 를 가지 며 , 둘 다 EF-G 와 구아노신 누쿨 레 오 티드의 리보솜에의 결합을 막는다. 이 두 항생제가 EF-G 의존 적 으로 일어나는 GTP 의 가수분해를 방해하는 것은 푸시드산의 방해작용과 유 사하지만, 그 작용 메카니즘은 다르다. 티오스트랩돈은 자리옮김을 방 해하지만 푸시드산은 그렇지 않다 (MondoIell 등, 1971a; Mondolell 등, 1971b). EF-G 가 리보솜 상에서 결합하는 자리에 관해서는 이미 2.7.2 절의 (가)항에서 기술하였다. 삼성분 복합체 EF-G·50S-GMP-[C H2] P 상에 서 EF-G 가 교차결합하는 단백질들은 L7 과 L12 임이 확인되었다. 5.2 원핵세포의 리보솜 상에서의 연장 5.2.1 아미노아실-t RNA 의 리보솜에의 결합 EF-Tu•GTP· 아미노아실-t RNA 복합체가 적당한 코돈을 가지고 있는 리보솜과 작용하면, 복합체는 리보솜에 결합하며, GTP 는 가수분해되 며, EF-Tu•GDP 는 방출되며, 아미노아실-t RNA 는 리보솜의 A 자리에 결합하여 머무른다. 만일 P 자리에 또 다른 아미노아실-t RNA 가 이미 결합되었을 경우에는 즉시 펩티드 결합이 형성될 것이다. 이 반응은 GTP 의 가수분해가 뒤따를 때에는 0°C 에서도 매우 신속 하게 일 어 난다 (Weis s bach 둥, 1971) . 리보솜은 또한 상당히 빠른 속도로 EF-Tu•GTP 를 가수분해한다 (Mi ller, _19 72) . 리 보솜은 과량의 삼성 분 복합체 또는 EF-Tu• GTP 에 의속해도서를 계포화산될할 수수 있있다기. 때삼문성에분 복복합합체체들에의 대해한리 상값수들와을 가보수면분 K해m의 = 최 l대x G10T-6P M에 이대고 한, 값Vm들, x은 = K m1 2= p m 4o xl e1/0-m6 i nM/A 2이6 0고· 리V보m,솜. =인 데1. 8반 pm해 서ol,e/ mEi nF/A -T26u0•· 리보솜이다. 이 실험치들은 삼성분 복합체는 EF-Tu•GTP 보다 더 강

하게 결합하며 더 신속하게 가수분해된다는 것을 증명해 준다. 그러나, EF-Tu·GTP 복합체는 단독으로도 리보솜에 대한 찬화력이 상당히 있 는 것으로 생각되고 있다. GTP 의 가수분해는 코돈과 역코돈의 상보적인 관계가 없이는 일어나 지 않을 것이기 때문에, 삼성분 복합체의 상호작용의 자리로서 일차적 으로 생각할 것은 코돈이 된다. 그러므로 Phe-tR :-:A·EF-Tu·GTP 복 합체는 풀리아데닐산을 결합한 리보솜에 의해서는 벌로 가수분해되지 않 는다. 위 에서 말한 바와 같이, EF-Tu·GTP• 아미노아 실- t RNA 가 리보 솜에 결합하면 GTP 가 가수분해된다. GTP 가 가 수분해되면 EF-Tu· GDP 와 P i가 형성된다. 리보솜에 결합한 아미노아 실- t RNA 한 분자 당 GTP 한 분자가 가수분해 된 다 (Brot 둥, 1970) . GTP 대 신 에 GM P - P(CH2)P 를 사용하여 도 아미 노아실 -tRN A 가 리 브솜 에 결 합되 므로, 아 미노아실-t RNA 의 결합에는 GTP 의 가수분해 자체가 요구되는 것이 아 님 을 알 수 있다. GTP 의 가수분해 는 리 보솜에 결 합한 아미 노아실-t RNA 를 적당한 자리에 놓이게 하거나 EF-Tu 를 리보솜으로부터 방출시키는 데 필요한 것으로 생각되어 왔으나, GTP 의 가수분해는 EF-Tu 의 방 출과 그 다음에 일어나는 펩터드 결합 형성에 필요한 형태 변화를 일으 키는 것으로 생각되고 있다. GTP 가 분해되면 EF-Tu•GDP 의 아미노 아실-t RNA 와 리보솜에 대한 친화도가 감소됨으로써 EF-Tu•GDP 가 이탈한다 (Ara i 등, 1973; Kawakit a 등, 1974). EF-Tu•GDP 가 방출되 지 않으면 펩티딜 기 전달효소의 활동성이 방해된다. 5.2.2 펩티드 결합 형성 리보솜의 A 자리에 아미노아실-t RNA 가 결합한 다음에 리보송의 P 자리에 위치한 펩티딜-t RNA 의 펩티딜 찬기의 카르복시 기와 A 자리 에 있는 아미노아실-t RNA 의 아미노 기 사이에 결합이 이루어침으로써 펩티드 결합이 형성된다. 펩티딜 기의 전달은 리보솜의 큰 하위단위체 에 위치한 펩티딜 기 전달효소의 작용으로 촉매된다 (Monro 등, 1969) (그림 5-3). 펩티딜 기의 전달에는 가용성인 인자들이나 GTP 가 요구 되 지 않는다 (Ma den 등, 1968) . 술프히 드릴 기 에 작용하는 약품들은 전 달 반옹에 영향을 미치지 않는다. 펩티딜 기 전달효소의 활동은 아미노아실-t RNA 의 아미노아실-아데

广三广r\ 一广PE P

上十푸로마이신

노신 말단의 유사체인 항생물질 푸로마이신을 사용하여 분석할 수 있다 (그림 5-4 및 그림 5-5 를 보라). 리보솜은 펩티릴-tRN A 유사체들인 풀 리페닐 알라닌-t RNA(Maden 등, 1968) 또는 울리고리실-tRN A(Go tt es-

。= 〈抽OcFLJ N-H. I. ’ 。 n t CNIH -HR-E Pp T D E 。 =》안〈1CCH1IOC - NH I OgC ' NC卜 H -H_RE . PP 。E

man, 196 7)로부터 펩티딜 기를 푸로마이신으로 전달한다. 푸르마이신 은 mRNA 및 펩티딜 기 전달효소 중심 이의의 리보솜 부분들과 상호작 용할 수 있는 아미 노아실-t RNA 의 구조적 요소들을 가지 지 않기 때 문 에 형성된 폴리페닐알라닌푸로마이신 또는 울리고리실푸로마이신은 리 보솜으로부터 방출된다. 펩티딜 기 전달효소에 관한 실험은 〈조각 반응 〉윤 기 웅하 여 할 수 있 다. 조각 반응이란 펩티딜-tR NA 대신에 NH2 가 가리어진 아미노산을 함유하는 울리 고누클레 오터 드 (예 , CACCA-AcPhe 또는 CAACCA-fM et 조각) 를 사용하여 50S 하위 단위 체 또는 70S 리 보솜 상에 서 푸로마이 신 과 결합시키는 것이다. 이 반응은 Mg 2+, K 리 및 알코올 들의 존 재하에 서 실시 한다 (Monro 와 Marcker, 1967 ; Maden 과 Monro, 1968) . 손상 되 지 않은 펩 티 딜-t RNA 분자들은 상응하는 〈조각〉들보다 더 반응성 이 큰 것으로 보아서, t RNA 가 리보솜에 효과적으로 결합하는 데에는 tR NA 분자의 CCA 말단 이의의 다른 부분들이 요구된다는 것을 알 수 있다. 정상적인 단백질 합성의 연장과정에 있어서는 자연의 펩티딜­ t RNA 는 전체 연장과정에 걸쳐서 리보솜에서 떨어져 나오지 않는다. 펩티딜 기 전달효소 중심의 구조가 아미노아실-t RNA 또는 펩 티딜­ tRN A 의 3' 말단에 상응하는 조각들을 사용한 친화표지법, 펩 티딜 기 전달효소를 방해하는 항생제물 사용한 친화표지법, 또는 리보솜의 재구

성 법 등으로 상당히 밝혀 져 있다. 이 것을 표 5-2 에 요약하였다. 50S 하 위단위체의 성분들의 약 반 정도가 펩티딜 기 전달효소 활동성과 관련 되어 있다. 표 5-2 에 실은 많은 단백질들이 펩티딜 기 전달효소의 활동 성에 직접적으로 관련되는 것은 아닐 것으로 생각된다. 펩티딜 기 전달 효소로 작용하는 한 단백질이 있고, 나머지 단백질들은 올바른 조립에

표 5-2 펩티딜 기 전달효소 중심을 재구성하는 데 중요한 리보송의 성분들

관여할 것으로 생각된다. L16 이 펩티딜 기 전달효소의 중심을 이루는 단백질로 생각되고 있다 (N i erhaus. 1980). 그런데 최근에 L16 은 tR NA 의 3' 끝을 결합하는 단백질이라는 것이 교차결합법으로 밝혀졌다(M a i­ mets 등, 1984). 따라서 Ll6 이 펩티딜 기 전달효소 중심의 일부분을 이루는 것은 거의 확실하지만 효소 그 자체는 아니라고 생각된다 (2.6.2 절을 참조하라)． 이전에는 L11 이 펩티달 기 전달효소 중심으르 인정되 어 왔다 (Ni er haus 와. Monte j o . 1973) . 최근에 Schmi d 등 (1984) 은 진성박테리아, 고대 박테리아, 및 진핵세 포 등에서 분자량이 약 30,000 달돈 되는 리보솜 단백질들이 면역학적 인 교차반응울 한다는 것을 알았으며, 이 단백질이 E. co li의 L2 임을 확인하였다. 그러므로 L2 는 리보솜 단백질 중에서 제일 많이 보존된.것

으로 생각된다• 위에서 말한 바와 같이 (표 5-2), L2 는 팸티딜 기 전달 효소 중심의 한 성분이기 때문에 매우 홍미를 끄는 단백질이다. L2 에 상응하는 단백질들의 아미노산 결합순서를 분석해 봄으로써 리보솜의 진화에 대한 정보도 얻을 수 있을 것으로 생각된다. 펩티딜 기 전달효소 중심과 관계되는 단백질들의 상대적인 위치들을 그립 5-6 에 도형으로 나타내었다. A' 자리는 A 자리의 일부분으로서

그립 5-6 펩티딜 기 전달효소를 이루는 50S 하위단위체의 성분들을 나타

아미노아실-t RNA 의 CCA- 아미노산 부분이 결합되는 부분이고, P' 자리 는 P 자리의 일부분으로서 펩티틸-t RNA 의 CCA- 펩티드 부분이 결합되 는 자리이다. 펩티딜 기 전달효소의 작용에 23S rRNA 의 U2584 가 관여한다는 것은 이미 2.4.4 절의 (마)항에서 기술하였다. 펩티딜 기 전달효소 중심의 본질이 리보솜 단백질 성분들의 어느 것인지는 아칙 규명되지 않고 있 다. 그러나, 23S rRNA 의 영역 e 에 위치한 것만은 확실히 밝혀져 있 다 (그림 2-20 및 그림 2-21, 및 그림 2-38 올 참조하라) • 현재 로서 는 펩 터딜 기 전달효소의 가장 유력한 단백질 성분은 L11 과 L16 이다. 펩티딜 기 전달효소의 작용 메카니즘에 관한 자세한 점은 아직 찰 모 르고있다. A 자리에 결합한 받개 기질로서 아미노아실-울리고누클레오티드들을 사용하였을 때 3' OH 에 아실화된 것들만이 펩티딜 기를 받을 수 있다.

2' OH 에 아실화된 이성질체는 받개로서 반응하지 않는다 (Pozd y akov 동, 1972 ; Chladek 등, 1973 ; Rin g er 와 Chladek, 1974) . 그러 나 tR NA 의 2'-0- 아미 노아실 유사체 는 푸로마이 신 반응과 CACCA-Phe 의 티 보 솜에의 결합을 방해한다 (R i n g er 동, 1975). 따라서, 2'-0- 아미노아실­ tR NA 유사체들은 A' 자리와 상호작용하고 펩티딜 기 전달효소에 의해 서 인식되기는 하지만 적절한 받개로서 작용할 수 있는 유리한 입체적 위 치 에 있지 않을 것으로 보인다. 그러 나, Phe-tR NAPh•-CCd3A 와 Phe- tRN APh•-CCAo,-red 둘은 느린 속도이 기 는 하지 만 AcPhe-tR N A 를 주개 로 사용하였을 때 그 것을 받을 수 있다 (Ch i nal i 등, 1974). 그러므로, 아미 노아실-t RNA 의 2' －이 성 질체 는 펩 티 딜 기 를 받아들일 수 있다. 펩티딜 기 전달반응에 있어서도 주개 기질의 입체화학적 특이성이 요 구되 고 있다. tR NA 의 2 '- 아미 노아실 유사체 들이 리 보솜의 P' 자리 에 결합되기는 하지만, 주개 기질로서는 이용되지 않는다. 따라서, 2'-0- AcPhe-tR NA-CCAo,-red (Hussain 과 Ofe n g an d, 1973 ; Chin a Ii 등, 1974) 와 2'-0-Phe-tR NA-CCdA (Sp ri n z l 과 Cramer, 1973 ; Chin a li 등, 1974) 는 펩티딜 기 주개로서 작용하지 않는다. 이 결과들은 3'-0- 펩티딜-t RNA 가 활동성인 주개 기질임을 암시하는 것아지만, 이성질화하지 않는 3'- 이성질체들을 얻어서 확인하기 전에는 이 결론은 결정적인 것이 못된다. 펩티딜 기를 전달하는 반응을 촉매하는 것 이의에도, 펩티딜 기 전달 효소는 펩티딜-t RNA 의 가수분해에도 관여한다. 여기에 관해서는 단백 질 합성의 종결을 논의할 때 다시 언급하기로 하겠다(제 6 장). 5. 2. 3 원핵세포에 있어서의 자리옮김 EF-G 와 GTP 가 자리옮김에 관여된다는 직접적인 증거들이 여러 가 지 실험둘로부터 얻어졌다. 앞에서도 언급한 바와 같이, 자리옮김 과 정에서는 (1) 아실화된 t RNA 의 A 자리로부터 P 자리로의 이동, (2) mRNA 의 이 동, (3) 리 보솜으로부터 의 탈아실화된 tR NA 의 방출 동 세 가지 반응이 일어난다. 자리옮김과 관련된 세 반응들 중 mRL~A 의 이동만이 실험적으로 증 명 되 었다. EF-G 와 GTP 와 함께 항온반옹시 킨 다음에 리 보솜에 의 해 서 보호되는 mRNA 조각의 길이는 3' 끝 쪽에서 세 개의 누클레오티드 만큼 더 길어진다 (Gu pt a 등, 1971; Thach 와 Thach, 1971). 자리옮김

이 일어나는 동안에 팹 티딜-t RNA 가 리보 솜 의 한 자리에서 다른 자리 로 이동하는 것에 대해서는 위 에서 말한 것과 비슷한 실험적 중거가 없 다. A 자리 에 팹 티 딜-t RNA 를 지닌 리보송을 EF-G 와 GTP 와 함께 항 온시키면 팸티덜-t RNA 가 푸로마이신과 반응 할 수 있는 상태로 변환된 다 (Lucas-Lenard , 1969) . 푸로마이신과의 반응성은 P 자리 에 있는 팹 티딜-t RNA 의 성질에 기인되는 것으로 생각하므로, mRNA 분자를 따 라서 일어나는 리보송의 이동은 펩 티딜-t RNA 의 P 자리로의 이동과 짝 지워져 있음을 알 수 있다. 이러한 실 험결과에서 티보 솜 에는 두 별개의 결합자리들이 있다는 생 각을 가지게 되었다 (S pir i n, 1969). mRNA 의 이동에는 tR NA 가 능동적으로 작 용 할 것으로 생각되고 있 다 (Lip m ann, 1969) . Lip m ann 은 tR NA 의 자리 옮김 과 mRNA 의 순차 적인 이동 사이의 짝짓기는 본질적으로 코돈-역코돈 상호 작 용에 기인될 것이라고 암시하였다. 코돈-역코돈 상호작용이 t RNA 의 자리옮김에서 중요한 역할을 할 것이라는 암시는 실제로 suf D 억압돌연변이체가 발 견됨으로써 뒷받침되었다. 이 돌연변이체는 h£s D 유전자리에서의 삽입 으로 생기는 읽기구조의 이동 돌연변이다. 이 돌연변이의 억압돌연변이 는 tR NAg ~G 에 대한 구조유전자에 있어서의 삽입 돌연변이라는 것이 밝 혀졌다. 억압 t RNA g~%의 역코돈은 CCC 대신에 네 개의 염기로 된 CC CC 이 다 (Ridd le 과 Carbon, 1973) . 코돈-역코돈 상호작용이 엄격히 유지되면서 t RNA 의 자리옮김이 일어 나는 데 대해서는 아직 실험적인 증거에 기초해서 설명할 수 있는 것은 아니지만 ,O f en g and 등 (1981) 은 다음과 갇은 모형을 제안하였다. 두 개

a b c

의 tR NA 분자가 리 보 솜 에서 배열 할 수 있는 방법 들을 그립 5 구 에 나타 내었다. 찬화표 지법 , 에 너지 전 달 에 의 한 거리 측 정 ( 자세한 것은 2.6.1 의 (나 ) 항 을 보라 )으 로 분석한 결 과에 의하면 그립 5-7 의 a 및 b 가 가장 그랄 듯한 배 열 이다. 이러한 배열에서 역코돈과 아미노산 끝 둘이 공히 나란 히 놓 일 수 있다. 펩티딜-t RNA 가 A 자리에서 P 자리로 이동 하는 것은 tR NA 부 분 에 있어서 L 구조의 중심부분에 해당하는 GT -we 부 분 이 크 게 회 전하면서 mRNA 를 이동시킬 것이라는 모형을 제안 한 사 람 도 있다 ( R i ch, 1974). GT-W C 부분의 희전은 리보솜의 형태 변 화로 유 발될 것으 로 생각된다. 자리 옮김과 동시에 탈아실화된 t RNA 가 리보송으로부터 방출된다 (Leder 등 , 1969). 자리 옮 김으로 촉진되는 탈아실화된 t RNA 의 방출이 일어나려 면 A 자리가 채워지는 것이 선결조건이다 (Lecas-Lenard 등, 1969 ; Ishit su ka 둥, 1970) . 다른 한편, 펩 티 딜 -tRN A 는 탈아실화된 tR NA 가 P 자리 에 없을 때 A 자리 에서 P 자리로 이동할 수 있다 (Tanaka 와 Kaji . 1972). 이것은 P 자리에 있는 탈아실화된 t RNA 는 펩티딜­ tR NA 에 의해서 밀 러나간다는 것을 의미한다. 동적 계에 있어서의 EF-G 의 촉진으로 일어나는 자리옮김은 GTP 를 필요로 한다. EF-G 는 자리옮김 과정에 있어서 촉 매적으로 작용한다 (Chin a li 와 Parmeg gian i, 1973) . 자리 를 옮긴 펩 티 덜 -tRN A 한 분자 마 다 한 분자의 GTP 가 가수분해된다 C\1ondolell 등, 1973). GTP 의 가 수분해는 자리옮김 그 자체와는 칙접적인 관계가 없고 EF-G 가 촉매적 으로 연 장회 로 에 다시 이 용되 게 하는 역 할을 하고 있다 (Inoue-Yokosawa 등, 1974 ; Monta n aro 둥, 1976) . 그러 므로, 자리 옮김 은 일 차적 으로는 EF-G 의 리보솜에의 결합으로 매개되는 것으로 생각되며, GTP 는 EF -G 가 리보솜에 부착하는 것을 촉진하는 리간드의 역할을 하는 것으로 생각된다. 자리옮김이 일어난 다음에 일어나는 것으로 추축되고 있는­ GTP 의 가수분해는 EF-G 또는 리보솜의 형태변화를 유발함으로써 EF-G 가 잘 방출되도록 하는 것으로 생각한다. 가용성 인자들과 GTP 가 없는 조건에서 일어나는 자리옮김 (비효소적 자리옮김)이 일어나는 것이 알려져 있다 (Gavr i lo v a 와 Sp irin , 1972; Gavrilo va 등, 1974) . 그러 므로, 자리 옮김 그 자체 는 리 보솜의 고유한 기능일 것이라고 생각되고 있다. 비효소적 자리옮김은 30S 하위단위처l 의 단백질인 S12 를 변형시키는 p -CIH g BzO~ 에 의한 처리로 촉진되며警

이 단백질을 30S 하위단위체에서 빼도 족전된다 (K i sha 둥, 1971; Brot 등, 1972). 그러므로, 이 단백질은 자리옮김에 대해서 제약적인 효과를 나타내는 메카니즘과 관련되어 있을 것으로 생 각된다. 5. 2. 4 GTPase 의 작용 및 연장에 있어서의 GTP 의 역할 한 회로의 연장과정이 작동할 때 두 분자의 GTP 가 가수 웁 해된다. 가수분해로부터 방출되는 에너지는 펩티드 결합의 형성 자체에는 필요 없는 것으로 보인다. P 자리에서의 펩티딜-t RNA 의 가수분해의 4G 0 은 -7 kcal/ 몰로 펩티드 결합의 형성 에 있어서의 -3 kcal/ 몰보다 훨씬 크 다 (Lip m ann, 1969). EF-Tu• GTP • 아미 노아실-t RNA 가 리 보 솜 에 결 합하 논 과정에서 한 분자의 GTP 가 필요하며, GTP 가수분해는 EF-Tu 가 리보솜으로부터 방출되는 데 필요한 것으로 보인다. 마찬 가지로 , GTP 가 없는 조건에서도 비효소적인 자리옮김이 일어나는 것으로 보아서, 자리옮김 과정에서 일어나는 GTP 의 가수분해는 일차적으로 리보솜으 로부터 EF-G 를 방출시키는 데 필요할 것으로 보인다. 이러한 결과들에 서 GTP 와 GDP 는 연장인자들과 리보솜에 대해서 다른 자리입체성 효 과물질로 작용할 것임을 암시한다. GTP 는 연장인자들이 리보솜에 결 합하는 것을 증진시키고, GDP 는 인자들의 리보솜에 대한 친화력을 감 소시킴으로써 방출을 증진시킬 것으로 생각된다. 5.3 진핵세포에 있어서의 연장인자들 진핵세포에 있어서의 연장 단계들은 원핵세포의 경우와 매우 유사하 다. 죽, 1) 코돈 특이성에 의한 아미노아실-t RNA 의 리보솜에의 결합, 2) 펩티드 결합의 형성, 3) 성장하고 있는 펩터드 사술의 A 자리에서 P 자리로의 이동 등 세 반응들이 단계적으로 반복한다. 이 세 반응둘 은 각각 연장인자 l(EF-1), 펩티 딜 기 전달효소, 및 연장인자 2(EF-2) 들에 의해서 촉매된다. 펩티딜 기 전달효소를 제외하고는 이 반응들에 관련되는 인자들은 가용성이며, 모두 고도로 정제되었으며, 그들의 작 용에 GTP 를 필요로 한다. 그렇지만, 펩티드 결합 형성에 관여하는 단 백질은 리보솜 단백질이며, 이 반응에는 의부로부터 가해 주는 고에너 지

화합물이 필요하지 않다 . 표 5-1 에서 진핵세포와 원핵세포의 연장과정 에 관여하는 인자들을 비교하였다 . 진핵세포에 있어서의 연장에 관해서 는 Brot (1982) 의 평 론서 를 보라. 5.3.1 물리적 성질 가) EF-1 EF-1 은 처음에 토끼의 망상적혈구에서 발견되으며 (Arlin g - haus 동, 1963), 그 후에 많은 동물조직들로부터 정제되었다. 여러 출처 들에서 단리한 EF-1 단백질의 분자량이 2,000 kdal 까지 되는 여러 가 지 크기 의 분자들의 응집 체 로 존재 한다는 것 이 특징 이 다 (Schneid e r 와 Moldave, 1968) （표 5-3) . EF-1 의 고분자량의 형 태 를 EF-1H 라고 부른 다. EF-1 의 여러 형태들이 분자량들의 큰 차이를 보이고 있지만, EF-1H 는 분자량이 50 kdal 정도인 가벼운 형태들로 이루어진 응집체이다 . 이 가벼 운 분자종들을 EF-1L 또는 EF-1. 라고 부른다. EF-1H 는 EF-1. 이 외에 적어도 다른 한 가지의 단백질을 더 가지고 있는데, 이 단백질을 EF-lp 라 고 부른다. 이 EF-lp 가 존재 해 야만 무거 운 형 태 EF-1H 로의 옹 집이 일어나는 것으로 생각되고 있다. 정제된 EF-lH 제조물에는 포스 포리피드와 콜레스테롤이 들어 있다 (Moon 등, 1973). 따라서 EF-1H 는 EF-h(EF-1.) 과 EF-l p(분자량 30 kdal 정도)의 하위단위체들로 이루어 지는 응집체이다. EF-1 의 무거운 형태의 생리적 역할에 대해서는 아칙 찰 모르고 있다. Arte m i a salin a 의 발육 과정 에 따라서 EF-1H 와 EF-h 의 상대 적 인 양 표 5-3 여러 출처에서 얻은 EF-1 의 분자량 출 처 응집체 단량체 kdal 누 어 1 200~600 60 망상적혈구 200~300 53 밀 싹 200~300 50 Krebs 복수 200~300 47 Arte m i a salin a 200~300 50 간 400~700 53 뇌 1,000~2,000 50

이 변 한다는 보고가 있 다 (Slobin 과 Moller, 1975) . 그리 고 엘 라스타아 재와 카르복시펩티다아제 등과 갇은 단백질 가수분해효소들이 EF-1H 를 EF-h 로 해 리 시 킨다는 것 이 관찰되 었다 (Twardowski 동, 1976; Twar- dowski 동, 1977). 아래에서 곧 기술하겠지만, EF-h 형태가 연장인자 로서 작용하기 때문에, EF-1H 형태는 이 인자의 저장형이라고 생각할 수 있 다 (Slobin 과 Moller, 1977) . 나) EF-2 EF-2 는 단일 폴리펩티드로 되어 있다. 이 인자도 토끼의 망상적혈구에서 발견되었다. 쥐의 간과 돼지 간으로부터의 EF-2 의 분 자량은 각각 110 kdal 과 100 kdal 으로 추정 되 고 있다. 밀 싹의 EF-2 의 분자량은 70 kdal 칭도이다. EF-2 의 독목한 성질은 디프테리아 독소와 NAD 가 있는 조건에서 ADP- 리보 실화컬 수 있다는 것이다 (H on j o 등, 1968). 뒤에서 곧 기술되겠지만, 이 반응은 그 목 이성이 매우 크다. 5. 3 . 2 EF-1 의 기능 EF-1 은 GTP 의존적으로 일어나는 아미노아실-t RNA 의 리보솜에의 결합을 증진시킨다. 아미노아실-t RNA 와 리보솜온 일정한 바율로 결합 하지만, EF-2 가 존재하는 조건, 죽 펩티드 결합이 형성되고 있는 조 건에서는 아미노아실-t RNA 의 결합은 촉매적인 성격을 가지게 된다. 원핵세포의 경우에서와 같이, 리보솜에의 결합에 앞서서 EF-1 은 GTP 및 아미노아실-t RNA 와 결합하여야 한다• 가) EF-1 의 구아노신 누클레오티 드 및 아미 노아실-t RNA 와의 상호작용 구 아노신 누클레오티드들은 EF-1 의 무거운 형과도 결합하고 가벼운 형과 도 결합한다. 이 반응은 oo 에서도 일어나고 37° 에서도 일어나며 2 분 이내에 반응이 완결된다. EF-1E 와 EF-1L 은 GTP 와의 결합이 좀더 강 하지 만, GTP 와도 결 합하고 GDP 와도 결 합한다 (Nag a ta 등, 1976; rvio o n 과 Weis s bach, 1972 ; Leg o ck i 등, 1974) . 이 것 은 원 핵 세 포의 경 우와 비 교하면 매우 대조적이다. 즉, 원핵세포의 EF-Tu•GDP 의 해리상수는 EF-Tu; GTP 의 것 보다 100 배 나 작다 (Mi ller 와 Weis s bach, 1970) 廳 돼 지 간의 EF-h 에 대 한 GTP 와 GDP 의 Km 값들은 각각 2. 0 X 1Q- 7 과 5. Ox 10-1 M 이 다 (Nag a ta 등, 1976) . Arte m i a ( Slobin 과 Moller, 1976)

와 소 뇌로부터의 EF-h 은 EF-1H 보다 GTP 를 결합하는 능력이 훨씬 더 크다. Arte m i a 의 EF-h 은 EF-1H 보다 10 배 나 더 많은 GTP 를 결 합하며, 소 뇌의 EF-h 은 EF-1H 보다 5 배나 더 많은 GTP 를 결합한 다. Arte m i a 의 EF-1H 에 서 EF-h •G TP (또는 GDP) 복합체 가 생 기 기 는 하지만, EF-h•GTP( 또는 GDP) 에 비하면 다소 불안정하다. 이성분 복합체 EF-h·GTP 는 아미노아실-t RNA 와 반응하여 삼성분 복합체를 형성한다. EF-h•GTP + 아미노아실-t RNA ➔ 아미노아실-t RNA·EF-h·GTP EF-ln·GTP 는 아미노아실-t RNA 와 거의 반응하지 않거나 전혀 반응 하지 않는다 (Moon 등, 1972 ; Slobin 과 Moller, 1976) . 이 러 한 결 과 에 서, EF-lu 는 아미노아실-t RNA 와 반응하는 동안에 EF-h 형태로 전환 되거나, 아니면 EF-1H 를 함유하는 삼성분 복합체가 불안정할 것임을 알 수 있다. 아직 증명되지는 않았지만, 삼성분 복합체가 형성되는 동 안에 EF-1 은 다음과 같은 전이과정을 밟는 것으로 생각된다. EF-h + GTP ~ EF-lu•GTP EF-h •G TP :;== EF-h· GTP EF-h·GTP + 아미노아실-t RNA ~ EF-h•GTP• 아미노아실 -tRN A 삼성분 복합체의 형성은 EF-h·GDP 와는 일어나지 않으며, 탈아실화된 tR NA 또는 NH2 기 가 가리 워 진 아미 노아실-t RNA 는 아미 노아실-tRt\T A 를 대신할 수 없다. 나) 삼성분 복합체와 리보솜의 상호작용 삼성분 복합체를 리보솜과 항온 반응시켰을 때, 삼성분 복합체의 성분들이 어떠한 변화를 받는지를 보 기 위 해 서 Weis s bach 등 (1973) 은 [3H ,r - 呼〕－ ATP 와 “C-Phe -tRi';rA 들로 이루어진 표지된 삼성분 복합체를 만들었다• 이 복합체를 리보솜 및 풀리 (U) 와 함께 항온반응시키면 Ph e-t RNA 는 리보솜에 결합되고, GTP 는 가수분해되고, 이성분 복합체 EF-l·GDP 가 화학양론적으로 형 성하였다. 항온반응 혼합물에서 풀리 (U)를 삭제하였을 때는 원래의 삼 성분 복합체가 그대로 리보솜에 결합되어 있었으며, GTP 의 가수분해 는 전혀 일어나지 않았다. 그렇지만, 뒤에 풀리 (U)를 항온반옹 혼합물

에 첨가하면 GTP 가 재빨리 가수분해되었다. 이 결과는 삼성분 복합체 논 리보솜에 대해서 매우 큰 찬화력을 가지고 있지만, 폴리 (U) 가 존재 할 때만 올바른 자리를 잡게 되어서 GTP 가수분해가 일어난다는 것을 암시 해 준다. Slobin 과 Moller (1976) 는 Arte m i a 의 EF-1 을 리 보솜, Phe-tR l~A , 풀리 (U) , 및 GTP 들과 항온반응시 키 면 가수분해 되 는 GTP 의 양은 항온반응 혼합물에 존재 하는 EF-1 및 Phe-tR NA 의 양에 비 례 한다는 것 을 알았다. 가수분해 는 Phe-tR NA 뿐 아니 라 리 보솜의 두 하 위단위체들의 존재에 의존해서 일어난다. 위에서 본 일련의 반응들은 원핵세포의 연장인자들에 의해서 일어나 는 것들과 매우 유사하다 (5. 1. 2 및 5. 2.1 절들을 보라). 다) EF-1 의 순환식 재이웅 위에서 말한 바와 같이, 삼성분 복합체 아 미노아신-t RNA·EF-h•GTP 와 리보솜의 상호작용의 결과로서 EF-h· GDP 가 형성된다. 이 이성분 복합체는 아미노아실-t RNA 와 반응할 수 없으므로, EF-1 이 촉매적으로 기능을 발휘하기 위해서는 EF-h·GTP 로 전환되어야 한다. 원핵세포에 있어서는 EF-Tu•GTP 를 재생시키는 일은 연장인자 Ts 가 한다 (5. 1. 2 및 5.1 .3 절을 보라). a) EF-Tu •G DP + EF-Ts ~ EF-Tu• EF-Ts + GDP b) EF-Tu• EF-Ts + GTP ~ EF-Tu • GTP + EF-Ts EF-l·GDP 와 GTP 사이의 교환반응을 촉진하는 단백질은 EF-1, 임 이 밝혀쳐 있다 (5.3.1 전의 (가)항을 보라). a) EF-lL' GDP + EF-1, ~ EF-h • EF-1, + GDP b) EF-h•EF-1, + GTP ~=츠 EF-h•GTP + EF-1, Slob i n 과 M6ller(1978) 가 최근에 EF-h·EF-1,•GTP 복합체를 검출한 것은 의미있는 일이라고 생각된다• 0°C 에서만 안정한 것으로 알려진 이 복합체는 EF-1, 로 촉진되는 교환반응에 있어서의 가상적인 중간물질이 다. 구아노신 누클레 오티 드의 교환반옹을 촉매 할 뿐 아니 라, EF-1, 는 EF-1L 의존적으로 일어나는 아미노아실-t RNA 의 리보솜에의 결합과 EF-1 및 EF-2 의존적으로 일어나는 폴리페닐알라닌의 합성둘도 촉진 시킨다. 두 반옹의 이러한 촉진은 아마도 EF-h·GDP 를 EF-h•GTP 로 전환시키는 EF-1, 의 능력과 관계되는 것으로 생각된다. 요컨대, 여러 진핵세포들에 있어서 EF-1 의존적으로 일어나는 아마

노아실-t RNA 의 리브 솜에의 결합에 관련된 반 응둘은 원핵 세포 계 에서 볼 수 있는 상응하는 반응 들과 매우 유 사하다. 그 단 계들을 그림 5-8 에 나타내었다. 거의 모든 조직들에 존재하는 것으로 알려진 EF-1 의 우거 운 형 태 ( EF - 1 H) 는 GTP 와 반응하여 EF-h·GTP 를 형성시키 는 것으로 생각된다. 그 다음에 EF-h·GTP 와 아미노아 실 -t RNA 가 상호 작용합

PEPL

으로써 삼성분 복합체 아미노아 실 -t R NA ·EF-h·GTP 가 형성된다• 그 다음에 는 이 복합체 로부터 의 아미 노아 실 -t RNA 가 리 보송의 A 자리 에 결합된다. 이 과정에서 GTP 가 가수분해되고 리보솜으로부터 EF-h· GDP 가 방 출 된다. EF-h·GTP 의 재생은 EF-1, 에 의해서 촉매되는 GTP-GDP 교 환 반응으로 이 루어 진 다. 5. 3. 3 EF-2 의 기능 가) EF-2 의 구아노신 누클레오티드 및 리보솜파의 상호작용 원핵세포와 진 핵세포의 연장인자들 사이의 유사성은 EF-G 와 EF-2 들에 있어서도 볼 수 있다• 두 가지 인자들은 다 GTP, GDP 및 푸시드산들과 상호작용한 다. 쥐 간의 EF-2 가 리보솜에 결합하는 데에는 GTP 가 , 있어야 한다 는 것 은 Skog e rson 과 Moldave (1964) 가 처 음으로 발견하였 다. EF-2 와 GTP 를 함유하고 있는 항온반옹 혼합물에 서 분리 한 리 보솜은 추가로 첨

가하는 EF-2 가 없어도 단백질 합성을 할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이 결과는 EF-2 가 리보솜에 결합된 채로 남아 있음을 가리킨다. 그 후 에 GDP 와 GDPCP 도 EF-2 의 리보솜에의 결합을 일으키게 한다는 것 이 알려 졌 다 (Skog e rson 과· Moldave, 1968) . 그러 나, 아미 노아실 -tRN A 의 리보솜에의 결합을 촉진할 수 있는 리보솜 ·EF-2 복합체는 GTP 에 의해서만 생길 수 있다. 이것은 EF-2 와 GTP 가 있는 조건에서 리보솜 의 A 자리에 있는 펩티딜-t RNA 가 EF-2 에 의해서 P 자리로 옮겨감 으 로써 리보솜의 A 자티가 아미노아 실 -t RNA 를 결합할 수 있게 된다는 것을 말해 준다. 정제된 EF-2 는 여러 가지 구아노신 누클레오티드들과 안정한 복합체 를 형성할 수 있다. 원핵세 포로부터는 안정한 EF-G· 구아노신 누큘례오 티드 복합체가 단리되지는 못하였지만, 그러한 복합체 형성이 일어난다 는 것이 평형두석법으로 밝혀졌다 (Ara i 등, 1977). 진핵세포의 경우에 는 여 러 생 물종들에 서 EF-2 •G TP 복합체 가 관찰되 어 있 다 (Bodley 와 Lin , 1972 ; Balig a 와 Munro, 1972 ; Chuang 과 Weis s bach, 1972 ; Mi z- umoto 등, 1974; Henrik s en 등, 1975a) . 마찬가지 로, GDP 와 GDPCP 도 EF-2 와 안정한 복합체를 형성한다. EF-2 와 GTP 를 리보솜이 있는 데서 항온반응시키면, EF-2, GDP, 및 리보솜이 1 : 1 : 1 로 함유된, 삼성분 복합체 리보솜 ·EF-2·GDP 가형 성 된 다 (Balig a 와 Munro, 1972 ; Mi zu moto 등, 1974 ; Henric k sen 등, 1975b). EF-2•GTP 복합체가 안정한 상태로 단리될 수 있기 메문에, 리보솜과 이 복합체의 상호작용은 GTP 를 가수분해시키는 결과가 된 다. 이러한 실험결과들에서 다음과 같은 일련의 반응이 일어나는 것으 로 생각되고 있다. a) EF-2 + GTP ~ EF-2 •G TP b) EF-2 • GTP + Rib ― ➔ Rib • EF-2 • GDP + Pi 그런데, GTP 대신에 GDP 또는 GDPCP 를 사용하여 삼성분 복합체가 생기므로, 이 반응이 GTP 의 가수분해를 필요로 하는 것은 아님을 알 수있다. A 자리에 펩티딜-t RNA 를 함유하고 있는 리보솜이 EF-2•GTP 와 상호작용하면 펩티딜-tR NA 가 P 자리로 옮겨가게 되며, 이와 동시에 GTP의 가수분해가 일어난다. 원래는 GTP 의 가수분해에서 방출되는

에너지가 자리옮김에 필요한 것으로 생각되었다. 그러나 EF-G 와 EF-2 들을 사용하여 연구한 바에 의하면 자리옮김은 GDP 의 존재 하에서는 일어나지 않지만 GTP 의 비가수분해성 유사체들의 존재 하에서도 일어 날 수 있음이 밝혀졌다. 이 결과들은 EF-2-GTP( 또는 GDPCP ) 의 리보 송과의 결합 자체가 자리옮김을 일으키는 데 충분하며, GTP 의 가수분 해는 EF-2 가 재이용될 수 있게 회전시키는 데 필요하다는 것을 암시해 준다. 푸시드산은 스테로이드 항생물질이며 원핵세포에 있어서 안정한 푸시드산 • 리보송 • EF-G·GDP 복합체를 형성하는 것으로 알려져 있다 (5.1 . 4. 절을 보라). 이 안정한 복합체가 형성됨으로써 EF-G 는 리보 송으로부터 떨어져 나울 수 없으며 따라서 촉매적으로 작용할 수 없게 된다. 이러한 관찰에서 푸시드산의 항생물질로서의 작용 메카니즘을 알 수 있다. 진핵세포에 있어서도 푸시드산의 방해작용의 메카니즘이 원핵 세포에서 관찰되는 것과 동일하다. 푸시드산은 리보솜에 결합된 EF-2 와 다음과 같은 일련의 반응으로 복합체를 형성한다. a) EF-2 + GTP ~ EF-2 • GTP b) EF-2·GTP + 리 보솜 - Ri b• EF-2-GDP + Pi c) Ri b· EF-2·GDP 그모프> 푸시드산 • Ri b· EF-2·GDP 단백질 합성이 일어나는 동안의 일련의 반응들을 보면, EF-2-GDP 는 자리옮김 반응에 뒤이어서 리보솜으로부터 떨어쳐 나울 것임을 암시해 준다. 유리된 EF-2-GDP 는 또다른 GTP 와 반옹함으로써 촉매적으로 기능을 발휘하게 된다. EF-l·GDP 와는 달라서 EF-2-GDP 는 추가적인 인자의 도움이 없이도 GTP 와 교환반응을 하여 EF-2·GTP 를 만들 수 있 다 (Mi zu moto 등, 1974) . 푸시 드산이 존재 하는 데 에 서 는 EF-2-GDP 가 리보솜에 포착되며, 그렇게 됨으로써 아미노아실-t RNA 가 결합되는 것을 방해한다. 왜냐하면, EF-1 은 EF-2 가 함유된 리보솜에는결합할 수 없 기 때 문이 다 (Bali ga 등, 1973 ; Nombela 와 Ochoa, 1973) . GTP 의 가수분해가 60S 리보솜 하위단위체에 40S 하위단위체를 첨가함으로써 다소 촉진되 기 는 하지 만, EF-2·GTP 복합체 의 리 보솜과의 상호작용 :::z. 리고 GTP 의 가수분해는 60S 하위단위체만이 필요한 것으로 보인다 (McKeehan, 1972). 이것 또한 원핵세포 계에서 관찰된 것과 매우 유 사하다.

나) 디프테리 아 독소에 의한 EF-2 의 활동성으 1 방해 Coryn e bacte r im n dip - h t hcr i ae 에 의해서 생성되는 디프테리아 독소는 분자량 62 kdal 정도 되 는 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된 단백질이며, 독성이 매우 크다. 치 사량은 50-100ng /k g 정도이다. 득이한 펩티드 결합과 이황화결합에서 전단되면, 이 단백질은 두 조각으로 분해된다. 조각 A 는 독소의 아미 노 말단에서 생기며 분자량은 21 kdal 이다. 한편 카르복시 말단에서 생 기 는 조각 B 는 분자량이 약 40 kdal 이 다 (Pap pe nheim er, 1977) . 디 프 테리아 독소의 독성은 EF-2 를 비활성화시키는 능력과 관계가 있다는 것이 밝혀졌다. HeLa 세포를 이 독소에 노출시키면 두 시간 이내에 단 백 질 합성 이 득이 하게 방해 된다 (Str a uss 와 Hendee, 1959) . 현재 는 이 독소의 독성작용이 이단계 과정이라는 것이 알려져 있다. 초기단계는 독 소의 조각 B 부분이 막의 특이한 수용체에 결합하는 것이다. 그 다음에 는 조각 A 가 세포질 안으로 방출되며, 거기서 EF-2 의 비활성화를 촉 매한다. 디프테리아 독소의 작용에 대한 세포내 저항성은 이 독소가 세 포막에 결합하지 못하기 때문에 생기는 것으로 생각된다. 여러 연구진 돌의 연구결과로 EF-2 의 비활성화는 독소와 NAD 가 촉매한다는 것이 밝혀 졌다 (Coll ier, 1967; Goor 와 Papp e nheim er, 1967; Raeburn 등, 19' 68) . Honjo 등 (1968) 은 디 프테 리 아 독소의 방해 작용의 메 카니 즘은 NAD+ 의 아데노신 이인산 리보오스 부분이 다음과 갑은 반응으로 EF-2 에 전달되는 것임을 알았다. NAD+ + EF-2 혼츠 ADP- 리 보실 -EF-2 + 니 코틴 아미 드 + H+ pH 7 및 반응물질들의 생리적 농도들에서 이 반응은 본질적으로 비가 역적이다. 그렇지만, 만일 NAD+ 를 제거하고, p H 를 낮추고, 과량의 니 코틴 아미 드를 첨 가하면, 독소와 비 활동성 인 ADP- 리 보실화된 EF-2 의 존재에서 EF-2 의 활동성이 회복된다. EF-2 가 독소에 의해서 ADP- 리보실화되면, 폴리페닐알라닌 합성을 촉매하는 EF-2 의 능력과 리보솜 의존적으로 일어나는 GTP 가수분해 의 방해가 따르게 된다. 디프테리아 독소에 의해서 촉매되는 EF-2 의 ADP- 리보실화 반응은 식물과 효모를 포함한 광범한 진핵세포들로부터의 EF-2 에 대해서만 목 이 하게 일 어 난다 (Van Ness 등, 1978) . 박테 리 아 또는 미 토콘드리 로부 터 의 EF-G 는 이 독소의 영 향을 받지 않으며 , 포유동물의 추출물 중에

서 이 독소의 영향으로 ADP- 리보실화되는 기질은 EF-2 뿐이다. 여러 가지 진핵세포들로부터의 EF-2 가 비활성화된다는 것은 EF_2 단백질은 디프테리아 독소의 인식에 필수적인 독특한 성질이 있을 것임을 암시해 준다. 실 제 로, Robin s on 등 (1974) 은 ADP- 리 보싣 화된 EF-2 를 트립 신 으로 처리하여 얻은 펩티드들 중에서 다음과 같은 15 개의 아미노산 찬 기를 가진 펩티드가 독소의 인식 부분임을 밝혔다. Phe-Asp- V al-Hi s- Asp- V al-Thr-Leu-Hi s- Ala-Asp- Ala-lle-X-Arg ADP- 리 보오스는 이 드문 아미노산 찬기 (X) 에 결합된다. 최근에 이 아미노산의 화학적 본질이 NMR 분광법으로 밝혀졌다. 이 아미노산은 약한 염 기 성 을 가진 2-(3- 카르복시 아미 도 -3- （트리 메 틸 암모니 오) －프로필 히 스티 단으로 그 구조가 결정 되 었다 (Van Ness 등, 1980) （그립 5-9 를 보라)• 이 아미노산의 관용명은 디프타미드이다. 아직 이 드문 디프타미드 잔기가 무슨 기능을 가지고 있는지에 대해 서는 찰 모르고 있다. 이 아미노산 유도체가 모든 진핵세포로부터의 EF-2 에서 발견되기 때문에 이 단백질의 기능에 필수적인 것이라고 추측할 수 는 있다. 그러나, 이 아미노산 유도체를 가지지 않는 EF-2 를 가진 돌연 변이체가 단리되었는데, 단백질 합성에는 결함이 없는 것으로 알려져 있 다 (Moehrin g 등, 1980) . 그러 므로 펩 티 드의 일 부분으로서 의 티 프타미 드 가 EF-2 에서 하는 역할에 관해서는 앞으로 더 연구하여야 할 문제이다.

H尸 숙 -CHz-CH( NH2)-COQ H HN 了2 N CH2 CH3 CI (H')+ NI ~ CH3 o= CI CI H3 如 2 그림 5-9 디 프타미 드의 구조

5.4 진핵세포의 리보솜 상에서의 연장 5. 4. l 펩티드 결합의 형성 펩티드 결합의 형성은 단백질 합성에 있어서의 그밖의 모든 반응둘이 가용성 인자 를 필요로 하는 것과는 대조적으로 리보솜의 큰 하위단위체 의 구조적 성분인 단백질에 의해서 촉매 된다. 이것은 원핵세포 계와 진 핵세포 계에 있어서 공통적이다(그립 5-3 을 참조하라)． 원핵세포 계에 서와 마찬가지로, 진핵세포 계에 있어서도 펩티드 결합의 형성은 펜디딜 기 전달효소의 촉매작용으로 리보솜의 P 자리에 결합된 펩티딜-t RNA 와 A 자리에 있는 아미노아실-t RNA 사이에서 일어난다. 이 반응에서 성장하고 있는 풀리펩티드 사슬이 아미노산 잔기 하나만큼 연장된다. 이 반응에는 추가적인 단백질 인자 또는 의부에서 가해 주는 에너지가 필요없다. 박테리아의 계에 있어서는 펩티드 결합 형성에 많은 리보송 단백질들 이 관여하는 것으로 알려져 있지만 (5.2.2 전의 표 5-2 를 참조하라), 진핵세포의 팹티드 결합 형성에 관여하는 단백질들에 관해서는 거의 알 려진 것이 없다. 촉매작용은 진핵세포의 리보솜의 60S 하위단위체에 있 으며, 린코마이신, 스과르소마이신, 아니소마이신들과 같은 항생물질들 뿐 아니라 그밖의 많은 화합물들에 의해서 방해된다(자세한 것은 제 7 장을 보라). 제 6 장에서 기술되겠지만, 펩티딜 기 전달효소는 단백질합 성의 종결반응에도 참여한다. 5.4.2 자리옮김 진핵세포에 있어서의 자리옮김은 원핵세포의 경우와 거의 갇은 메카 니즘으로 일어난다(그림 5-1 을 참조하라)． 단백질 합성에 있어서 제일 찰 이해되지 않고 있는 과정은 리보솜이 mRNA 를 따라서 움직이는 과 정일 것이다. 각 아미노산이 첨가될 때마다 리보솜은 mRNA 의 5' 쪽 에서 3' 쪽으로 정확히 한 코돈(즉, 세 개의 염기)만큼 움직인다. 리보 솜의 A 자리 상에서 갓 생긴 펩티드 사슬은 자리옮김의 결과로 P 자리 로 옮겨가며, P 자리에 결합된 탈아실화된 t RNA 는 밀려나며, 리보 송은 mRNA 의 3' 끝 쪽으로 세 개의 염기만큼 이동한다. 이 결과로

A 자리에는 새로운 코돈이 오게 되고, 이 빈 A 자리에 새 아미노아살 -tRN A 가 결 합하게 된 다. 이 과정에서 작용하는 EF-2 의 기능에 관해서는 5.3.3 절을 보라. * 참고문헌 Allende, J.E . , Monro, R., Lipm ann, F. (1964), Proc. Natl . Acad. Sci. 51, 1211 . Arlin g h a us, R. , Favelukes, G. , Schweet, R. (1963) , Bio c /z e m. Bio p /z y s. Res. Co1111111111. 11, 92, Arai, N. , Arai, K. , Kazir o , Y. (1977) , ]. Bio c hem. 82, 687. Arai, K.I., Kawakit a, M., Kazir o , Y., Maeda, T., Ohnis h i, S. (1974), J Bio l . C/ze m . 249, 3311, Arai, K. I. , Ka w a ki t a, M. , Nakamura, S. , Ishik a wa, I. , Kazir o , Y. (1974) , ]. Bio c / w m. 76, 523, Balig a , B. S. , Munro, H. N. (19 72) , Bio c/zim . Bio p h y s . Acta 277, 368. Bali ga , B. S. , Schechtm an, M. G. , Munro, H. N . (1973) , Bio c / ze m . Bio p /z ys . Res. Co1111111111. 51, 406. Beaud, G. , Leng yel , P. (1971) , Bio c hemi st r y 10, 4899, Bodley, J. W. , Lin , L. (1970) , Natu re 227, 60. Bodlie y , J.W ., 'liev e, F.J. , Lin , L , Zie v e, S.T. (1969), Bio c lzem. Bio p h y s .. Res. Commun. 37, · 437. Bodley, J. W. , Zie v e, F.J . Lin , L. , Zie v e, S. T. (1970) , ]. Bio l . Chem. 245, 5656. Brot, R. (1982) , Prote i n Bio s yn th e sis in Eukaryo t e s (Ed. , R. Perez-B e rcoff ) , p. 253. Plenum Press. New York. Brot, N., Redfi el d, B., Weis s bach, H. (1970), Bio c /1 e 11 1 . Bio p /z ys. Res. Commun. 41, 1388, Brot, N., Yamasaki, E., Redfi el d, B., Weis s bach, H. (1972) , Arch. Bio c / 1e m. Bio p h y s . 148, 148. Chen, C. -M., Ofe n g an d, J. (1970) , Bio c lzem. Bio p / 1y s. Res. Commun. 41, 190. Chaung , D. M. , Weis s bach, H. (1972) , Arch. Bio c lzem. Bio p /z ys . 152, 114. Chladek, S., Rin g e r, D., Zeml ick a, J. (1973) , Bio c hemi st r y 12, 5135. Coll ier, R.J. (1975) , Bacte r ia l. Rev. 39, 54. Coll ier, R.J. (1976) , J Mo!. Bio l . 25, 83. Coop er , D. , Gordon, J. (1969) , Bio c he m is tr y 8, 4289. Fahnensto c k, S., Weis s bach, H., Ric h , A. (1972), Bio c / 1im . Bio p !z ys. Acta 269, 62.

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제 6 장 단백질 합성의 종결과정 펩티드 사슬의 종결이 일어나면 멘 마지막으로 리보솜에 결합한t RNA 로부터 완성된 펩티드가 떨어져 나온다. 펩티드 사슬의 종결은 리보솜 상에서 일어나며 원핵세포와 진핵세포에서 모두 가용성인 단백질 인자 ` 둘을 필요로 한다. E. coli 세포에서 발견된 두 가지 단백질 인자들(방 출 인자, RF) 은 그들의 코돈 독이 성 이 서 로 다르다. 즉, RF-1 은 UAA 또는 UAG 를, RF-2 는 UAA 또는 UGA 를 인식 한다. 토끼 의 망상 적 혈구와 바다 새우 Arte m ia salin a 에서는 UAA , UAG, 및 UGA 코돈둘 울 인식하는 한 가지 RF 가 알려져 있다. 박테리아의 RF-1 과 RF-2 의 리보솜과의 결합 및 방출에는 제 3 의 단백질 인자, RF-3 이 관여하는 · 데, 이 인자는 GDP 및 GTP 와 상호작용한다. 망상 적혈구와 Arte m t .a sal in a 의 RF 는 GTP 에 의해서 촉진되며 리보솜-의존성 GTPase 의 작 용을 가지고 있다. 사술 종결 단계에서의 펩티딜-t RNA 의 가수분해는­ 리보솜에 결합되어 있는 효소인 펩티딜 기 전달효소를 필요로 한다. 6.1 종결 코돈 종결 코돈이 존재할 것이라는 것은 처음에 무의미 돌연변이들에 관한· 유전학적 연구로 예견되었다 (Garen, 1968). 무의미 돌연변이란 아미노.

산 코돈이 펩티드 종결 코돈으로 전환되는 것을 말한다. 무의미 코돈이 제일 잘 알려진 것은 박테리아이지만 진핵세포에서도 많이 알 려쳐 있다 (Ozeki 동, 1980 ; Pip e r, 1980 ; Late n 등, 1980 ; Kohli 둥, 1980) . 무 의미 돌연변이는 다음과 같은 여러 가지 효과와 목 징을 나타낸다. (1) 염기 변화를 일으키는 돌연변이 유발제들에 의한 복귀 돌 연변이가 일어 날 수 있다. (2) 야생종에서 볼 수 있는 표현형의 성질을 전혀 볼 수 없 다. (3) 〈유전자외 〉 억압돌연변이에 의해서 표 현 형의 성 질 이 달라질 수 있다. (4) 접속된 mRNA 에 있어서 (원핵세포의 경우) 돌연 변 이가 일어 난 위치로부터 먼 쪽으로 있는 시스트론들의 번역을 감소시킨다. (5) 조 숙된 펩티드 사슬 종결과 함께, 돌연변이된 유전자 산물의 아미노말단 조각들이 나타난다. 종결 코돈의 생화학적인 성질은 처음에 E. col i의 염기성 탈인산 가수 분해효소 유전자에서 일어나는 무의미 돌연변이에 관한 연구로 알게 되 었다(W e ig er t 등, 1966). 이러한 무의미 돌연변이체들은 유전자의 억압 유전자들에 의해서 유전적인 정정 (즉, 억압)을 받게 된다는 것이 밝혀 졌다. Garen 은 억압유전자의 독이성을 이용하여 무의미 돌연변이체들과 억 압유전자들을 암버 부류와 오크르 부류로 나누었다 (Garen 동, 1965;

트U립U토G판

림 6-1) (Weig e rt 와 Garen, 1965) . 이 아미 노산들에 대 한 동의 코돈둘 중의 하나(그림 6-1 중에서 밑줄친 것)가 암버 코돈과 단 하나의 염기 변화로 달라졌다고 가정함으로써, 코돈 UAG 는 암버 코돈에 상응하는 트리누클레오티드라고 예견할 수 있었다. 바슷한 점근법으로 오크르 코 돈에 상응하는 트리 누클레 오티 드는 UAA 임 이 확인되 었다 (We ig e rt 등, 1967) . Brenner 등 (1967) 은 rl[ 돌연 변 이 체 를 사용하여 암버 또는 오크르 억 압유전자들로 정정되지 않는 또 하나의 무의미 돌연변이종들을 확인하 였다. 따라서 이 돌연변이는 UAA 또는 UAG 에 상응하지 않는 또 다 른 것임을 알 수 있었다. 이러한 결과에서 제 3 의 무의미 코돈이 있을 것임을 추측할 수 있었다. Sambrook 등 (1967) 은 UGA 에 특이한 억압 유전자를 얻어냈다. UGA 종결 코돈을 오팔 코돈이라고 한다. 이와 같 이 , 유전 학적 연 구들로 UAA, UAG, 및 UGA 들이 무의 미 코돈들입을 알았으며, 만일 이 무의미 코돈둘이 돌연변이체에서 일어나면 조숙한 펩티드 사슬의 종결이 일어난다. 1974 년대 초기에는 f2, R17, 및 MS2 둘과 같은 RNA 박테리오파지들 에 있어서의 RNA 둘의 시스트론과 시스트론 사이의 부분들의 누클레 오티드 결합순서가 부분적으로 결정되었다(Nic hols, 1970; N i chols 와 Roberts o n, 1971) （그림 6-2). 그림 6-2 에서 볼 수 있는 바와 같이, 의 피 단백 질의 C- 말단에 대 한 코돈 다음에 종결 코돈 두 개 (UA AUAG) 가

입성효소 외피단디칼

나란히 있다. 이 RNA 들에 있어서는 UAA 에서 여덟 개의 코돈을지나 서 세번째의 종결 코돈이 있다. 아마도 이 세번째의 종결 코돈은 혹시 일어날지도 모르는 종결의 착오를 방지하는 역할을 하는지도 모른다. 최근에는 mRNA 의 단리법과 그 일차구조의 분석법이 많 이 발전되어 있기 때문에 원핵세포와 진핵세포의 mRNA 둘의 결합순서가 알려져 있 는 것이 매우 많다. 이러한 예들을 제 3 장의 그립 3-1,3-2 및 3-3 에 소개하였다• 이러한 예들에서 자연적으로 일어나는 종결 코돈이 UAA, UAG 및 UGA 둘이라는 것이 분명해졌다. 6.2 무의미 돌연변이의 억압 E, co li의 무의미 돌연변이는 UAG( 암버), UAA( 오크르), 및 UGA (오팔) 코돈 동에 의해서 일어나고 있다. 이 세 코돈들에 대한 t RNA 들 이 정상적인 세포에서는 존재하지 않기 때문에, 이 세 코돈둘은 아미노 산에 대한 정보를 가지지 못한다. 따라서 무의미 코돈에 대한 정보 독 이성을 변화시키는 돌연변이가 tRN A 유전자에서 일어난다면, 달라진 이 t RNA 는 번역이 일어나는 과정에서 특이한 아미노산을 삽입시킬 수 있게 됨으로써 다른 유전자들에서 일어난 무의미 돌연변이를 억압하게 될 것이다. 억압인자 유전자에 돌연변이가 일어난 경우에는, 돌연변이체는 보통 양성 (su+) 을 나타냄 으로써 정 상적 인 유전자들과 다르며 그의 대 립 유전 자인 야생형 유전자 (su- ）에 대해서 우성이다. 따라서, 무의미 억압인자 유전자를 지닌 군주들의 검출이 비교적 쉽다. 실제로, 박테리아에서는

s11+1, s11+2, su+B, su+C 둥의 여 러 가지 무의 미 억 압인자 유전자들이 검출되었다. 이들은 염색체 상에서의 위치들과 삽입하는 아미노산들이 무엇인지에 의해서 구별된다. 앞에서 말 한 바와 같이, 무의미 억압인자 유전자들은 그들의 코돈 독 이성 에 따라서 분류된다. 즉, 암버 (UAG ), 오크르 (UAA), 및 오팔 (UGA) 억압인자 유전자들이 있다. 억압인자로 작용하는 몇 가지 t RNA 둘의 예를 들어 보자. 무의미 억 압인자 유전자가 tR NA 에 대한 구조 유전자라는 멘 처음의 결정적인 중거는 UAG 코돈에 대한 반응으로 티 로신을 삽입하는 su+3 에 관한 연 구에서 얻어졌다. 거의 모든 무의미 억압인자들은 억압인자로 작용하는 tR NA 에 있어서 누클레오티드 변화가 단 한 군데에서 일어난 것이다. 가) 티로신을 삽입하는 stt+ 3 암버 및 szi+ 4 오크르 억압인자 su+3 억 압인자 는 t RNA,T” 의 구조 유전자의 돌연변 이체의 하나이며 그의 역코돈에서 Q ➔ C 의 단일 영기 치환이 일어난 것이다(Q는 G 의 유도체이다)． 그러 므로 이 t RNA 는 UAG 코돈이 있는 데서 티로신을 삽입할 수 있다. 오 크르 억압인자 유전자 su+4 는 같은 위치에서 Q ➔ U 돌연변이몰 한것이

A`A'2 『-VG....G ACCCACCACUG三 야GGGG 8A28Uu138· l0

다. 따라서 UAA 또는 UAG 가 있는 데서 티로신을 삽입할 수 있다 (Smi th, 1972) . 나) 글루타민 또는 트립토판을 삽입하는 szt + 7 암버 및 sIt+ 8 오크르 억압인자 유전자들 su+? 은 t RNAT” 에 대한 구조 유전자의 역코돈 돌연변이체이 다(그립 6-5). t RNAT” 에서는 CCA ➔ CUA 의 역코돈 돌연변이가 일어 난다 (Soll, 1974; Yaniv 등, 1974). 억압인자 유전자 SI t +8 은 CCA(su-7) ➔ CUA(su+?) ➔ UUA(su+s) 과 같은 두 단계 돌연변이로 일어날 것으로 생각된다 (Yan i v 등, 1974). 이 역코돈을 가진 t RNA 는 글루타밀-t RNA 합성효소에 의해서 찰못된 아미노아실화가 일어난다. K 립--o 는연 이뎅오체 팔이 U GAkcC로X卜 G u전7c cL’억 c cG +인9K C } 는어 ’G t RG 대 N굽 CA TrCHp A1A A

..

대립적인 성질을 가진다. 그림 6-4 에 나타낸 바와 같이, 돌연변아 자 리는 역코돈에 있지 아니하고 24 번 위치 (D 줄기)에서 G ➔ A 로 달라진 것이다. UGA 에 대한 코돈 인식의 변화는 돌연변이체 t RNA 의 형태변

화로 일 어 나는 것 으로 추정 된 다 (Hirs h, 1971 ; Buckin g h an . Kurland~ 1980) . 라) 그밖의 굴루타민을 삽입하는 암버 및 오크르 억압인자들 su+2 및 su+B 여 압인자 tR NA 둘을 그림 6-5 에 나타내 었다 (Ozek i 등, 1980).

그.립FG- DG A6AA-A5G: G:C두:감p邑_A CGGGGU ( t aR:•••••• )N A I~CGtCCC言A(~ CSGU A:u i ♦ nu ,. (a :) :tCRN GA 1G1• : sAu -IB1S ➔1G csAUAnA뇨 u +1DB ;g5/2 U (겅b냅CGA·CAccGMUGP)GUc\UC( u ^tR •cN ^ G|'^)山_fA•GCCAAUCGC.CccCGGCCAC12 G:8U/C8c1죠%^/\ •: :• CsU——CuAn•-n I2U ➔c일 • sA u• + c2•. iA•Sutb

위에서 본 바와 감이, 원핵세포에 있어서의 정보전달의 억압현상은­ 유전암호와 단백질 생합성의 메카니즘을 해명하는 데 중요 한 역할을 하 ­ 였다. 진핵세포에 있어서의 무의미 돌연변이의 억압에 관한 연구는 효 ~ 모에서 제일 많이 이루어졌다(효모에 있어서의 억압인자 유전자의 돌연 변이의 종류에 관한 목록은 Mor tim er 와 Sc hi ld(1981) 를 보라). Saccharomy cescerev is ia e 에 있어서의 무의미 억압인자의 돌연변이체 ’ 들의 경우에도 UAA, UAG, 또는 UGA 등의 무의미 돌연변이에 상응하 는 것들이 알려쳐 있다• 이 돌연변이체들은 각각 UAA( 오크르), UAG - (암버), 그리고 UGA( 오판) 등의 무의미 코돈들 중의 한 코돈에서만 억 압을 일으킨다. UAA 와 UAG 억 압인자 유전자들은 이소 -l- 시토크롬 c 에 대한 구조 유전자 상에 오크르 또는 암버 돌연변이룰 받은 군주들-

(5. 2. 2 절을 보라)을 분석 함으로써 알 수 있었다 (Sherman 둥, 1973; Scherman 등, 1979) . 효모에 있어서의 무의미 억압현상이 원핵세포에서와 같 이 변형된 tR NA 분자들에 기 인된다는 것에 대한 중거는 원핵세포의 경우 와 마찬 가지 방법으로 얻어졌다 . 죽, 한 가지 방법으로는, 억압인자 유전자를 지닌 효모 균주에서 단리한 전 tR NA 혼합물을 시험관 내의 단백질 합 성계에 첨가하면 무의미 코돈에 반응하여 아미노산 을 삽입 할 수 있다. 또 한 가지 방법에서는 억압인자 유전자에 돌연변이가 일어나면 억압인 자로서 작용하는 tR NA 의 역 코돈에 서 염 기 변화가 일어 난다는 것을 누 쿨레오티드 결합순서 분석으로 알 수 있다.

AccAGAGGGCcmGuucv AC

6.3 방출인자들 펩티드 사슬의 종결에 단백질 인자들이 관여할 것이라는 것은 처음에 Ganoza (1966) 에 의 해 서 제 안되 었 고, 뒤 에 Cap ec hi 와 Klein (1969) 에 의 해서 증명되었다. 시험관 내에서의 펩티드 사슬의 종결을 분석하는 방 법이 발달됨으로써 코돈에 특이한 두 개의 단백질 인자들을 E. co li에서 확인하는 데 성공하였다. 개시복합체 3H- f Me t-t RN A' ~1•AUG 터보솜을 펩티드 사슬 종결반응의 기질로 사용하여, 3H- f-메티오닌(펩티드의 유 사체로서)의 방출에는 단백질 인자들, 종결 코돈둘이 필요하다는 것이 밝혀졌으며, 어떤 조건에서는 구아닌 누클레오티드들이 필요하다. 코돈-독이한 두 가지 방출인자들이 E. col i로부터 정제되었다(표 6-1). RF-1 은 UAA 또는 UAG 에 목이 하고, RF-2 는 UAA 또는 UGA 에 득 이하다. 이 인자들은 울리고누클레오티드나 폴리누클레오티드를 전혀 가 지고 있지 않으므로 코돈 목이성은 단백질의 인식 메카니즘으로 생기 는 것이다 . 이 산성 단백질들은 그 물리적 성질들이 상당히 다른 데도 불구 하고 공통되는 면역학적 결 정 인자들을 가지고 있는 것으로 보아서 구조 적인 상동성이 상당히 있을 것으로 생각되고 있다 . Mi lm an 등 (1969) 은 세 번 째 의 인 자 RF-3 을 발견 하였 다 . RF-3 은 종 결 코돈이 있는 조건에서도 펩티드를 방출시키는 기능을 가지지 않지만 표 6-1 가용성 인 사숟 방충 인자들 인자 분K `r 량 ( .`d a ) 코돈­ 독-。 · 성 GT P 인 식­ 황 성리 등보G성 솜T 의aP 존eS E. coli RF-1 47• UAA 와 UAG 없음 없음 RF- 2 483, 35b UAA 와 UGA 없음 없음 RF-3 46a 없음 있음 있음 토끼의 망상적혈구 RF 56. 53, 1Q5 b U및 A UAGAA, UAAGA, 있음 있음 Arte m i a salin a RF 50b, 80C 있음 있음 a : SOS 전기이동법 b: 평형침강법 c: 세파덱스 겔 용리법

RF-1 과 RF-2 의 작용을 중진시 키 는 역 할울 한다. 이 단백 질 인자는 GTP 또는 GDP 와 상호작용하며 , RF-1 과 RF-2 의 리 보솜에 의 결 합과 리 보솜으로부터 의 방출을 촉진 한다 (Caskey 와 Camp b ell, 1979) . EF-Tu 도 같은 촉진작용울 한다는 것을 발견함으로 써 RF-3 와 EF-Tu 는 등일 한 물질 이 라고 주장되 기 도 하였지 만 (Cap ec chi 와 Kleim , 1969) , Caskey 의 연구실에서 RF-3 의 활동성을 EF-Tu 의 것과 분리시키는 데 성공하 였다 (Goldste i n 과 Caskey, 1970) . 그러 므로 RF-3 은 펩 티 드 사슬의 종 결에 특이하게 관여하는 인자이고 연장인자는 아니다. 진핵세포의 방출인자는 처음에 토끼의 망상적혈구에서 단리되었고 다 음으로 포유동물의 간과 곤충 세포들에서 단리되었다. 토끼의 망상적혈 구의 방출인자의 물리적 인 독성들을 표 6-1 에 주었다. 시험관에서의 실 험에서 단 한 가지의 단백질 인자가 테트라누클레오티드 UAAA , UAGA 또는 UGAA 둘의 존재 에 서 토끼 의 리 보솜 상의 기 질 인 [3 H]-fM et- t RNA;M•••AUG· 리 보솜으로부터 포르밀 〔 3H J-메 티 오닌의 방출을 촉진 시켰다. 테트라누클레티드의 3' 위치를 다른 염기들로 치환하여도 인식 작용에는 불리한 효과가 없는 것으로 보아서, 트리누클레오티드 보다는 테트라누클레오티드를 요구하는 것은 시험관 내의 분석에 있어서의 득징 이라고 생각된다. 그러므로 3' 말단의 염기는 인식작용의 일부분으로서 작용하는 것이 아니라 코돈 인식 복합체에서 하나의 안정 요소가 된다. 망상적 혈구의 RF 는 GTP 와 GDP 와 상호작용하며 리 보솜-의 존성 GTP ase 의 반응을 증진시 킨다 (Goldste i n 등, 1970) . 6.4 종결 코돈 인식 아미노산 코돈둘의 인식에 있어서와는 달리, 펩티드 사술 종결의 안 식은 핵산이 또 다른 핵산울 염기 짝지움으로 인식하는 원칙에서 벗어 나는 일이어서 상당한 관심의 대상이 되어 왔다. 리보솜 상에서의 펩티 드 사술 종결 코돈의 인식작용을 분석하기 위해서 3H 로 표지된 종결 코돈을 사용하여 방출인자 • 〔 3H] －종결 코돈 • 리 보솜 복합체 의 형 성 을 조사하였 다 (Scolnic k 와 Caskey, 1969) . 이 와 같은 실 험 에 서 , RF-1 은 UAA 및 UAG 에 옹하여 리 보솜에 결합하며 , 한편 RF-2 는 UAA 와 UGA 에 옹하여 리보솜에 결합한다• 리보솜의 부재 하에서의 방출인자

의 코돈 인식의 목이성이 절대적인 것이 아니지 만 방출인자 분자가 코 돈 인식에 관여된다는 것이 확인되었다 (Ca p ecch i ~-l- Klein , 1969) . 아주 최근에는 제한 핵산내부가수분해효소들과 같은 단백질들에 의한 DNA 의 특정한 누클레오티드 연속부분의 인식에 관한 연구들이 광범위하게 이루어지고 있다. 방출인자의 〈역코돈〉 부분의 분자구조에 관해서는 아직 잘 모르고 있 다. 그렇지만, 코돈 인식작용의 득이성을 m3UAG, m3UAA , m5UAG, m5UAA . brUAG, hUAG 및 UAI 등과 같은 변 형 된 트리 누클레 오티 드 들을 이용하여 간접적으로 연구한 바에 의하면, 이 트리누클레오티드들 의 방출인자에 대한 독이성은 Wa t son - Cr i ck 의 염기 짝지움과 코돈-역 코돈 염기 짝지움에 있어서의 동요현상과 상당히 유사하다는 것이 밝혀 졌 다 (Smrt 등, 1970) (표 6-2 와 6-3 을 보라) . 우라실의 N3 위치에 메딜 기를 결합시키면 RF-1 또는 RF-2 에 상% 하는 종결 코돈둘의 주형으로서의 활동성이 없어진다. 반면에 우라실와 Cs 위치에 브로모 또는 메딜 기를 부착시키면 종결 코돈의 주형으로서 의 활동성에 아무런 영향을 미치지 않는다. hUAG 는 RF-1 의 존재에 표 6-2 변형된 종결 코돈둘의 주형으로서의 작용 트리누클레오티드 포르밀 (면〕－메 티 오닌

염표기 6-인3 식의종 결유 현코 돈| 갑염기＼들麟의 인麟식서목이 성인 식되는 염기들 i 실식되지 않는 염기 I 첫 째 U, brU, 또는 m5U I m!U, hU, C, A, G II 둘째 또는 세 째 A, G (또는 I) I U, C 血 둘 째 또는 세 째 A I U, C, G (또는 I) 서 종결 코돈으로 작용하지 않는다. 이러한 실험결과들은 N3 위치의 수 소와 c4 위치의 카르복시 부분이 종전 코돈의 인식에 필 수적인 반면에 Cs 위치에 부착된 치환기들은 필수적이 아님을 가리킨다. 16S rRNA 의 3' 말단 부분에 있는 Shin e -Dalga rno 연 속부분이 mRNA 의 종결 코돈을 인식하는 데 관여한다는 것은 이마 2.4.4. 절의 ( 나)항 에 서 이 미 기 술하였 다. Dalga r no 와 Shin e (l973) 은 이 러 한 연 속부분의 말단에 UUAoH 가 있을뿐 아니라 이 연속부분의 8 개의 잔기 안에 UCA 가 있다는 것을 발견하였다. 이러한 삼중체들이 UAA , UAG , 그리고 UGA 들과 염기 짝지움을 할 수 있을 것이다. 종결 코돈의 인식에 있어 서 의 16S rRNA 의 3' 말단의 중요성 은 클로아신 DF13 이 라는 록 이 한 핵 산 가수분해효소를 사용한 연구결 과 에서 분명해 졌 다 (Caske y 동, 1977). 리 보솜에 있는 16S rRNA 의 3' 말단으로부터 49 개 의 누쿨레 오티 드를 찰 라내면 방출인자들에 의한 코돈 인식능을 없애버린다. 그러나 방출인자 의 매개로 일어나는 펩티딜-t RNA 의 가수분해반응은 그대로 일어난다. 코돈 인식에 미치는 핵산 가수분해효소의 이러한 영향이 리보솜 구조의 교란의 결과로 생기는지는 아직 확실히 모른다. Caskey 등 (1977) 은 또 한 E. col i의 방출인자에 의한 B. subti lis 리보솜 상의 코돈의 인식이, B. subti lis 의 16S rRNA 의 3' 말단이 종결 코돈들에 상보적 인 결 합순 서를 가지지 않더라도, 정상적으로는 아무 변화가 없다는 것을 관찰하 였다. 이러한 실험결과들에서 RF-1 과 RF-2 분자들이 종결 코돈을 직 정 인식한다는 것을 알 수 있다. 토끼의 망상적혈구 추출물에 있어서는 단 한 가지의 단백질 인자가 제 가지 종결 코돈 전부를 인식한다. 따라서 사정은 E. col i의 경우와 상당히 다르다. E. col i와 토끼의 망상 적혈구로부터의 방출인자들은 동족의 리 보솜들과만 작용한다 (Ko neck i 등 1977) .

6. 5 RF-3 및 GTP 가수분해 의 요구 단백질 인자 RF-3 은 방출작용은 없지만 RF-1 또는 RF-2 그리고 종 결 코돈들에 의해서 매개되는 f Me t의 방출을 촉진시킨다. E. col i의 RF-3 는 RF-1 과 RF-2 의 리 보송에 의 결 합과 리 보솜으로부터 의 방출을 중진 시 킨 다 (Goldste i n 과 Caskey, 1970) . RF-3 은 펩 티 딜 -tRN A 가수분 해의 Vmax 에는 영 향을 미치지 않으면서 종결 코돈들에 대한 RF-1 또는 RF-2 의 Km 을 5 내지 8 배만 큼 감소시킨다. 이 사실은 RF-3 이 작용 하는 단 계는 코돈을 인식 할 때(즉, 리보솜에 결합할 때)이지 펩티딜 -t RNA 의 가수 분해 단계가 아님을 의미한다 (M i lman 둥 1969). 실제로 RF-3 은 RF-1 또는 RF-2. 〔 3H J UAA· 리보송 중간체의 형성을 촉진한다. RF-3 의 존재 하에서 이러한 인식 복합체에 GDP 를 첨가하면 복합체들 이 신속히 해체하게 된다. RF-3 이 리보솜-의존성 GTPase 활동성을 가 지고 있는 것으로 알려져 있기는 하지만, RF-3 이 존재하는 조건에서 RF-1 또는 RF-2 의 리보솜에의 결합에 GTP 가 요구되는지는 아직 밝 혀져 있지 않다. 리보솜-의존성 GTPase 의 활동성을 가진 다른 단백질 인자 EF-G 가 RF-1 또는 RF-2 와 함께 리보솜에 동시에 결합할 수 없 을 것이라는 것은 명백한 일이다. 왜냐하면, Mccaug h an 등 (1984) 의 최 근의 연 구에 의 하면 RF-1, R-2 및 RF-3 들이 결 합하는 리 보솜 상의 위치는 L7/L12 줄기와 S2 및 S3 등이 아루는 경계면인데, 비교적 큰 RF-3 와 EF-G 가 동시에 같은 영역에 결합할 수는 없을 것이다 (6.7 절 참조)． 따라서 RF-1 과 RF-2 의 결합과 방출은 RF-3 에 의해서 촉진되 며 GTP 와 그의 가수분해가 관여할 것임을 침작할 수 있다. 그러나 아 직 이 연속적인 순환과정에 대한 증거는 시험관 내에서의 실험으로는 증명이 되지 않고 있다. 망상적혈구와 RF 를 사용한 펩티드 사슬 종결에 있어서의 GTP 및 그의 가수분해 문제의 경우에는 사정이 명확하다. 진핵세포의 방출인 자는 리보솜-의존성 GTPase 의 활동성을 가지고 있으며, 이 활동성은 코돈들에 의 해 서 두드러 지 게 촉진된다 (Beaudet 와 Caskey, 1971) . RF 의 리 보솜에 의 결 합은 GTP 또는 그의 비 가수분해 성 유사체 인 GDPCP 들에 의해서는 촉진되지만, GDP 에 의해서는 촉진되지 않는다. 그렇지 만 RF 의 촉매로서의 행동을 촉진하는 것은 GDPCP 가 아니라 GTP 인

것으로 보아서, GTP 는 RF 의 리보솜에의 결합을 촉진하며, 그 후에는 곧 가수분해되는 것으로 생각된다. 가수분해가 일어난 다음에는 RF 와 GDP 를 리보솜으로부터 밀어낼 것이다(그립 6 구을 보라).

펩티딜 기 RF, GTP

6.6 펩티 딜-t RNA 의 가수분해 팹티드 사술 종결에 있어서의 50S 리보솜 하위단체의 펭티 딜 기 전달 효소로서의 활동성의 역할은 처음에 펩티딜 기 전달효소의 작용과 사슬 종결의 펩 티 딜-t RNA 가수분해 단계 둘 다를 방해 하는 항생 제 들에 관한

연 구에 서 알게 되 었 다 (Beaudet 와 Caskey, 1971) (5. 2. 2 절 참조) . 만일 에탄을의 첨가로 RF 분자들을 리보솜에 결합시킬 수만 있으면, 펩티드 . 사슬 종결의 이 부분반응을 알아 볼 수 있을 것이다. 아미세틴, 린코신, 클로람페니콜, 그리고 스과르소마이신들과 같은 항생제들은 펩티딜 기 전달효소의 작용과 RF 로 매개되는 펩티딜_t RNA 의 가수분해 를 모두 다 방해한다. 이 항생제들은 코돈들에 대한 반응으르 일어나는 RF 의 리보솜에의 결합은 방해하지 않는다. 이것은 이 항생제들이 펩티드 사 술 종결의 독이한 부분반응을 방해한다는 것을 가리키는 것이다. 펩티딜 기 전달효소가 펩티딜-t RNA 의 가수분해 를 비롯해서 몇 가 지 촉매작용을 한다는 것은 시험관 내에서의 실험으로 증명할 수 있다 (Scolnic k 등, 1970). 아미노기가 친핵체로서 아미노아실-t RNA 의 에스 테르 결합을 공격할 때 이 효소는 펩티드 결합 형성을 촉매한다. 이 반 응은 보통 아미노아실-t RNA 에 의한 펩티드 사슬의 연장이 일어나는 동 안에 볼 수 있다. 또한, 친핵체가 알코울일 때는 펩티 딜 기 전달효소 중심이 에스테르 형성을 촉매할 것이고, 친핵체가 물일 때는 갓 생긴 펩티 딜-t RNA 의 가수분해 를 촉매한다 . RF 가 에스테르 가수분해효소로 서의 작용을 하지 않으며 펩티딜 기 전달효소가 펩티딜-t RNA 의 가수 분해에 요구되지 않는 것으로 보아서, RF 는 펩티딜 기 전달효소와 상 호작용함으로써 펩티릴-t RNA 의 가수분해를 촉진하는 것으로 보안다. 린코신 (E. col i의 리보솜의 경우)과 아니마이신(토끼의 망상적혈구의 경 우) 두 항생제들이 각각 상응하는 리보솜 상에서 펩티드 결합과 에스데 르의 형성 그리고 펩티딜-t RNA 의 가수분해를 일으키는 펩티딜 기 전 달효소에 미치는 영향이 차별적이라는 사실은 매우 홍미있는 일이다. 두 항생제는 각각 해당하는 리보솜 상에서 펩티드 결합과 에스데르 결합의 형성을 방해하는 한편 펩티딜-t RNA 의 가수분해를 현저하게 촉진한다 (Beaudet 와 Caskey, 1971) . 펩 터 딜 기 전 달효소의 특이 성 의 이 러 한 변 형은 린코신이나 아니소마이신이 아니라 RF 가 변형제로서 작용하면서 사술 종결 단계에서 일어날 것으로 추측된다. E. coli 의 리 보솜의 특정 한 단백 질들에 대 한 항체 들을 사용하여 Tate 등 (1975) 은 펩티딜 기 전달효소가 펩터드 사술의 종결에 참여한다는 중 거를 얻을 수 있었다. E. col i의 50S 리보솜 단백질들인 Lll 과 Ll6 에 대한 항체들은 RF- 의존적으로 일어나는 펩티딜-t RNA 가수분해에 영향 을 미침으로써 시험관 내의 실험에서의 종결을 방해한다. 그러나 이 항

체들은 RF 와 리보송의 상호작용에는 영향을 미치지 않는다• 최근에 펩 티딜 기 전달효소 중심을 이 루 는 단백질들로서 Lll 과 Ll6 임이 밝혀졌 다(자세한 것은 2.6.2, 철과 5.2.2, 철을 참고하라)， 그러므로, Lll 과 Ll6 은 종결 단계에서 팹티딜-t RNA 의 에스페르 결합을 분해하는 반응 에서 중요한 역할을 할 가능성이 크다. 아직 확실 한 것은 아니지만 Lll 상에 있는 두 개의 다른 자리들이 펩티드 결합의 형성과 펩터딜-t RNA 의 가수분해에 따로따로 관여할 가능성도 있으며, 아니면 가수분해반 응에서는 RF 와 펩티딜 기 전달효소 사이의 상승작용이 관여할지도 모 른다. L16 은 클로람페니콜을 결합하는 단백질이며, 펩티딜 기 전달효 소가 이루는 A 자리 부분의 일부분을 이루는 것으로 추측되고 있다 (Ni er haus 와 Monte j o , 1973 ; 2. 6. 2 절 및 5. 2. 2 절 을 참고하라) . Ll6 에 대한 항체가 시험관 내에서의 종결 단계의 부분반응인 펩티딜-t RNA 의 가수분해를 방해한다는 것은, 이 가수분해가 일어날 때 RF 분자가 A 자리의 일부분을 차지할 것임을 암시한다. 왜냐하면 이 반응에 관여 하는 그밖에 알려진 성분들에 의해서 차지된 자리들(펜티딜-t RNA p자 리, 펩티 딜 기 전달효소 Lll) 이 콜로람페니콜에 의해 영향을 받지 않 기 때문이다. Ll6 과 Lll 은 펩티딜 기 전달효소 중심의 일부분을 이루 는 인접한 단백질들이므로, RF 와 펩티딜 기 전달효소는 기능적인 면에 서 상호작용할 것으로 추측할 수 있다. 6.7 RF 가 결합하는 리보솜의 자리 (1) 항생제, (2) 특정한 단백질들에 대한 항체, (3) 몇 가지 단백질 들을 제거한 리보솜들, (4) RF 와 리보솜 단백질과의 교차결합 등을 사 용하여 펩티드 사슬 종결에서 요구되는 리보솜 단백질들에 관한 연구를 하였다. 이러한 실험결과들을 종합해 보면 RF 의 결합자리는 리보송의 어떤 접촉 영역임을 가리키고 있다. 리보솜 단백질 S4 와 L4 가 펩티드 사슬의 종결에 관여하고 있다. 항 생제 스트랩토마이신과 에리트로마이신은 펩티드 사슬 종결의 방해물질 인데, 이들 두 단백질들 (S4 와 L4) 에 돌연변이가 일어나면 이 항생제들 에 대 해 서 저 항성 을 가지 게 된 다 (Beaudet 와 Caskey, 1971) . 리 보솜의 특정한 단백질들에 대해서 만들어진 항체들을 사용하여, L7/L12, S2,.

S3 들과 같은 단 백질들 이 RF 의 결합에 요 구 된 다는 것과 L16 과 L11 이 : 펩티딜-t RNA 의 가수분해에 영향을 미친다는 것이 밝혀져 있다 (Ta te' 등, 1975). 5. 2. 2 절에서 도 이미 언급한 바와 같이, 이 단백질들은 각 ` 각 팹 티 딜 기 전달효소 중심의 일부분과 주변 영역을 이루고 있다는 것 이 알려져 있다(표 5-2 를 보라). L16 과 Lll 은 둘 다 클로람페니콜의 결 합 에 요구되 고 있 다 (Ro th 와 Nie rh aus, 1975) . 17/112 가 제 거 된 리 보 솜은 RF 몰 결합할 수 없다. 이것은 항체물 사용하여 얻는 결과를 확 ­ 인 해 주 는 건과 이 다 . 리보솜에서 L1l 을 제거하여도 펩티딜 기 전달효 ­ 소의 완동성은 크게 영향을 받지 않으며 펩티드 사술 종결에 미치는 영 향도 거 의 없 다 (Ar mstr o ng 과 Tate , 1978) . 이 작용기 성 교차결 합제 를 사용한 실 험 에 서 RF 는 L2, L7/112, Lll, S17, S21, 및 S18 등과 o}- 주 가 깝게 접촉하 고 있다는 것이 밝혀졌다 (S t e ffl er 등, 1982). Pon g s 와 Rossner(1975 ) 는 종결 코돈 UGA 의 유도체를 친화표지 탐침으로 사용_ 하여 RF 가 코돈을 인식하였을 때 RF 가 S18 및 S14 들과 교차결합될 수 있음 을 알았다. EF-Tu 가 펩티딜 기 전달효소의 중심을 이루는 여 러 가지 단백질들 (A 자리의 단백질둘)과 접촉하기 때문에 종결 코돈을 ­ 인식할 RF 가 EF-Tu 와 상호작용하는 단백질들과 접촉하게 되는 것은 놀라운 일이 아니다(그립 5-6 을 보라). 6.8 펩티드 사슬 종결 단계에서의 조절 앞에서도 말한 바와 같이, 우의미 돌연변이는 조숙한 사슬 종결을 알 으키며 미완성된 단백질 조각들을 방출시킨다. 억압 tR NA 돌연변이돌­ 을 지닌 세포들에 있어서는 이러한 무의미 돌연변이들이 표현적으로는 t 억압된다. 억압돌연변이체에서의 아미노아실-t RNA 는 종결 코돈들을 인 식하여 그들을 번역한다. RF 와 억압 t RNA 가 종결 코돈을 놓고 경쟁 한다. 그러므로 억압돌연변이체에서의 유전자 표현의 조절은 종결(죽, . 무의미 코돈)과의 인식 단계에서 이룩된다. 단백질 사슬 종결을 방해하는 억압 t RNA 들이 있음이 알려짐으로써, 칭상적인 종결반응에서도 목수한 t RNA 가 종결 코돈을 인식할 것이라 는 집요한 가정이 오랫동안 계속되어 왔다. 그러나 오늘날에는 몇 가­ 지 방출인자들이 종결 코돈들을 인식한다는 개념이 정립되었다.

그러나 리보솜이라는 복잡한 기능적 구조가 해결되기 전에는 펩티드 사술 종결이 일어나는 과정에서의 펩티딜-t RNA 의 가수 분해 반응의 메 카니즘을 자세히 설명하기가 힘들 것이다. 방출인자들의 하나가 가수분 해작용에 참여하는 것은 거의 확실하지만, 리보송에 방출인자 가 결합하 는 것만으로는 펩티딜-t RNA 의 가수분해를 개시시킬 충분한 조전 이 되 지 않는다. 가수분해가 방출인자들과 리보솜의 한 성분과의 상호협동에 기인되는 것인지는 아직 명확하지 않다. 그러나 방출작용이 가능하러면 리보솜이 활동적인 형태로 있어야 하는 것만은 분명하다. 요컨대, 최근 까지의 지식을 집약하여 제안된 매력적인 이론은, 펩티딜 기 전 달효소 가 종결 코돈과 방출인자들에 의한 특별한 영향으로 합성이 아니라 가 수분해를 일으킵으로써 사슬 종결이 일어날 것이라는 것이다. 종결반응 은 앞으로 이 정립된 이론에 기초하여 설계된 접근법으로 연구되어야 할 것으로 생각된다. * 참고문헌 Armstr o ng , I. L, Tate , W. P. (1978) ) , J Mol. Bi ol . 120, 155. Beaudet, A.L., Caskey, C.T. (1971) , Proc. Natl . Acad. Sci. 68, 619. Brenner, S. , Barnett , L. , Katz , E. R. , Cric k , F. H. C. (1967) , Natu r e 213, 449. Buckin g h am, R. H. , Kurland, C.G. (1980) , Transfe r RNA: Bio l og ica l Aspe c ts (Ed. , D, Soll, J. N. Abelson, P, R, Schim mel) , p. 421, Cold Sp ri n g Harbor Laborato r y , Cold Spr i n g Harbor. 'Ca pe c chi, M. R. , Klein , H. A. (1969) , Cold Sp ri n g Harbor Sy m p . Qu ant. Bio l . 34, 469. Caskey, C.T., Bosch, L., Konecki , D.S. (1977) , ]. Bio l. C!z e m. 252, 4435. Caskey, C.T., Camp b ell, J.M . (1979), Nonsense muta t i on and tR NA supp r essors (Ed., J. E. Celis, J.D . Smi th) , p. 81, Academi c Press, New York. Dalga rno , L., Shin e , J. (1973), Natu r e New Bio l . 245, 261 . Gallucci , E. Garen, A. (1966) , ]. Mo!. Bio l . 15, 193. Ganoza, M. C. (1966) , Cold Sp ri n g Harbor Sy m p . Qu ant. Bi ol . 31, 273. Garen, A. (1968) , Scie n ce 160, 149. Garen, A., Garen, S., Wi lh elm, R.C. (1965), ]. Mol. Bi ol . 14, 167. Goldste i n , J. L. , Beaudet. A. , Caskey, C. T. (1970) , Proc. Natl . Acad. Sci. 67, 99. Goldste in , J. L., Caskey, C.T. (1970), Proc. Natl . Acad. Sc i. 67, 537.

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제 7 장 단백질 합성의 방해물질들 개요 단백 질 합성의 방해물질들은 번역과정의 전체 메카니즘과 개별적인 각 단 계 들의 메카니즘을 해명함에 있어서 매우 유용하게 사용되었다. 단백질 합성의 방해물질로 작용하는 것들로는 항생물질과 그밖의 물질 들이 있다. 단백질 합성계에는 적어도 두 가지 (원핵세포의 계와 진핵세 포의 계)가 있다. 그러나 이 두 계에는 많은 공통점들이 있다. 표 7-1 에서 볼 수 있는 바와 갇이, 단백질 합성의 방해물질에는 원핵세포에만 작용하는 것, 진핵세포에만 작용하는 것, 원핵세포와 진핵세포에 다 작 용하는 것들로 분류할 수 있다. 또한, 방해물질들은 작용하는 자리가 상 충 액인지, 작은 하위단위체 (30S, 40S) 인지 또는 큰 하위단위체인지 에 따라서 분류할 수 있다. 일반적으로 보면, 원핵세포 계들에 작용하 는 항생물질들은 박테리아, 남조류, 미토콘드리아 및 영록체 들에 영향 을 미치며, 진핵세포 계에 작용하는 것들은 80S 제포질성 리보솜을 가 진 고동생물의 세포에서만 작용한다. 리보솜에 두 가지 유형이 있다는 것을 처음에 알게 된 것은 클로람페니콜이 70S 리보솜에 결합하여 단백 질 합성을 방해하지만 80S 리보솜에는 결합하지 않는다는 사실을 알게 됨으로써 가능하였다 (Vazq uez, 1964). 방해물질들은 그들의 화학구조에 따라서 분류될 수도 있다. 표 7-2

표 7-1 단백질 합성의 방해뭉질들 상충액 30S(40S) 50S (60S) 원핵세포 폴산 길항뭉질 아미노글리코시드류 I 클로람페 니콜 L-1- 토실 아미 도 -2- 스트랩토마이신 페닐에틸클로로메틸 디히드로스트랩토마이신 I 마크롤리드류 케론 (TPCK) 파로모마이신 니다마이신 카르보마이신 키로마이신 네오마이신 스피라마이신 모시마이신 카나마이신 루코마이신 X-5108 겐타마이신 에리트로마이신 불루엔소마이신 칼코마이신 울레안도마이신 스펙티노마이신 란카마이신 메티마이신 카수가마이신 네가마이신 린코사미도류 에데인 셀레스토사미니드류 에데인 A 콜에리데신인 E3B I 스P트A랩 1토14그A라 민 A 군 오스트레오그라이신 스트랩토그라민 A 페난트렌 알칼로이드류 베르나마이신 A 크립토플레우린 미카마이신 A 틸로크레브린 틸로포린 | 스트랩토그라민 B 군 오스트레오그라이신 B PA114B 등 비리도그(에리타세마인0 1 신) 티오스트랩돈 군 티 오악(브스틴리)트아 랩마돈 이 신, 티 시오마이신 A 티오렌틴 B 물터오마이신

상충액 30S(40S) 50S (60 S) 스포란기오마이신 A-59 알티오마이신 미크로콕신 보트로마이신 A2 풀러 1 우로물틸린 원핵세포와 진핵세포 아구아미닐노 알-5킬' ＿ 메아틸데렌닐 산류 1 오팍린타마트이리신카 르복시산 푸아로미마노이아신실 올리고누쿨 이포스폰산 례티드류 4- 아미노핵소오스 피 리미딘 누쿨레오서 푸시드산 드류 구게로틴 아미세틴 불라스티시먼 S 풀리아세틴 바미세틴 히키지마이신 스과르소마이신 테트라시클린류 쿨로르테트라시클란 진핵세포 디프데리아 독소 글루티리미드류 시쿨로핵시미드(악티 디온) 아세목시시클로핵시 미드 스트랩토비타신 A 이페카크 알칼로이드류 에메틴 아니소마이신 트리코테센류 트리코테신 트리코데르봉 크로토신 니바렌울 T-2 독소 베루카린 A

상 충 액 30S( 40 S) 50S( 60 S) 테누아 존산 아브린 및 리 신 페데린 세 팔로탁 수 스 알칼 로이드 류 하링토닌 호 모하 링 토닌 이소하링 토 닌 MDMP Na F, KF MDMP 는 2-( 4 - 메틸 - 2, 6 - 디니트로아 닐리 노 ) -N- 메밀 프로피 온 아 미드의 약자 이다. 에서는 방해물질들 을 그들의 화 학 구조에 의거 해 서 분류하였다. 이 표에 는 분자량과 방해물 질 이 작용하는 자리 그리고 방 해되는 목 이한 자리들 에 관한 청보들을 실었다. 지금까지의 연구결과에 의하면, 거 의 모든 항생제들과 그밖의 방해물 질들은 리보송의 독정 한 한 성분과 독이하게 작용함으로써 단백질 합성 올 방해하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 항생제들이 작용하는 성분들 (리보솜 단백질 또는 리보솜 RNA) 그리고 이 성분 분자들 상에서 항 생제 분자가 부착하는 특이한 위치 (아미노산 찬기 또는 누 클 레오티드) 등을 알게 됨으로써, 각 항생제가 단백질 합성의 어느 단계 (개시, 연장, 및 종결)에서 방해작용을 하는지를 알 수 있냐 그러므로, 단백질 합성 의 방해물질들은 단백질 합성의 자세한 메카니즘뿐 아니라 단백질 합성 이 일어나고 있는 리보솜의 구조를 밝히는 생화학적인 도구로 이용될 수있다. 몇 가지 방해물질들의 화학구조를 그림 7-1 과 그림 7 - 2 에 나타내 었다. 단백질 합성의 방해물질들에 관해서는 몇 가지 훌 륭한 평론서들이 있 다. 자세한 것은 이 평론서들을 참고하기 바란다 (Cundl iff e, 1972b; -Va zqu e z, 1979 ; Pestk a , 1977 ; Cundli ffe, 1980 ; Vazqu e z 와 Jim enez, 1980).

부방해여포포세세·서주에1 주 에f물^+ + ++++ ++ ++ + + ++ + + + + + + + +++ + 방되해는 세포종 , I핵핵원진 진핵 진 핵진 핵핵진 원핵 )핵(진 핵진핵 진 핵 원핵 원핵 원핵 원핵 원핵 원방 되 응는반해되해방 계단는P TG해가 분수강,연개 시 김전딜팹 자（)기 옮티,달 리 장연전, 옮달리) （팹단김터기 자 연장 달 옮 자 딘, 기（김펩리)티전장 ,시연결)개( 종팹옮딜)（ 전 , 리자달김기디 장연 개Nt돈짝코,-a-a, RA기 시짓 종)장( 시연개, 전 종 결 김옮리자 연장 김옮리자 장연l lll.._. (( '~`',`A7A777 77,’ 77티종장연딜팹결빼) ,(달결전종 티딜맵연전장종. 종결() ` ,달전 |.(김 리)자옮달전 , 장연 딜티펩 .(김리자) 옮말전 , 장연 딜티팬 | .|.옮( 김리자)달전 . )시개(장인 딜티팬옮( 리김자)달전 , 장연 딜티팹 방의해분 량자 자리 E -uFT, 2.2 512,FG E- -F2I, l:E, F-!FE 니 . 35S7 69202S 3.36079 3 .1806S5 2 9 3.69330 S82 .38420 SF 2E-, 30006 E2-F00,2 045 0S.5640 55 S0 9.442 95??~Q 788 7379841 896995S5 00S5 0S5 ’ 0S5 진I

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7.l 원핵세포에 대한 항생물질들의 작용방식 7. 1. 1 단백질 합성의 개시 및 종결에 미치는 영향 단백질 합성의 개시과정은 당연히 항생물질들에 의해서 목이하게 작 용을 받을 것으로 생각되지만, 이 과정을 득이하게 방해하는 항생물질 은 거 의 없 다. 카수가마이 신 이 fM et- tR NA! M ei 의 30S 하위 단위 체 와의 결합을 방해하는 것이 밝혀져 있어서, 개시과 정의 목 이한 방해물질이라 고 생각되고 있다 (Oku y ama 둥, 1974). 오린트 리카르복시산과 같은 트 리페닐메탄 염료류는 시험관 내 실험에 있어서 mRNA 의 30S 하위단위 체와의 결합을 방해하는데, 이 과정은 다른 항생물질들 에 의해서는 영 향을 받지 않는 것으로 알려져 있다. 시험관 내 실험에서 단백질 합성의 개시반응을 방해하는 또 다른 약제는 에데인이라는 것인데, 이 방해물 질은 원핵세포와 진핵세포의 단백질 합성계를 다 방해하는 것으로 알려 져 있으며, mRNA 또는 개시 t RNA 가 30S 또는 40S 하위단위체에 결 합하는 것을 막는 것으로 알려 져 있다 (Kur y lo-Boroska 와 Hi er owski, 1965 ; Szer 와 Kmy lo -Borowsk, 1972) . 진 핵 세 포의 추출물에 서 는 낮은 농도에서는 팍타마이신이 풀리펩티드 사슬의 개시반응의 방해물질로 ~ 용하지만 높은 농도에서는 사슬 연장을 방해한다. 그러나, 박테리아의 계에 있어서는 팍타마이신의 개시와 연장에 미치는 효과들은 겹쳐지기 때문에 개시반응의 특이한 방해물질로서는 이용할 수 없다 (S t ewar t와 ” Goldberg, 1973) . 풀리펩티드 사슬의 종결의 특이한 방해물질로서 알려진 것은 하나도 . 없다. 폴리펩티드의 방출반응에는 펩티딜 기 전달효소가 관여하는데, 이 반응은 이 효소에 작용하는 클로람페니콜과 스파르소마이신 등에 의해 서 방해된다. 그리고, 종결 코돈둘은 리보솜의 A 자리에서 방출인자들 · 에 의해서 인식되는데, 이 인식작용은 티오스트랩튼 또는 클로르테트라 시클린이 A 자리를 막음으로써 방해된다. 7.1.2 생체 내에서의 푸로마이신 반응에 미치는 항생물질들의 영향 여러 가지 항생물질들이 박테리아의 원형질체에서의 단백질 합성을

정지시키며 갓 생긴 펩티드 사슬을 크게 손실시킴이 없이 폴리솜을 〈동· 결 〉 시킨다. 이어서 이러한 계 에다 푸로마이신을 첨가해 봉으로써 그러 한 항생제들의 작용방식을 해명할 수 있다 . 약간의 항 생 물질들은 갓 생긴 펩티드가 푸로마이신에 의해서 리보솜 으로부터 방출되는 데에는 영향을 미치지 않으면서 생체내에서의 던맵 질 합성을 정 지시킨다. 이것은 이러한 항생물질들이 펩티딜 기 전달효­ 소에 의한 반응에도 영향을 미치지 않으며 자리옮김도 방해하지 않는다 는 것을 말한다. 왜냐하면 만일 이 두 반응이 영향을 받았다면 갓 생긴 패티드는 리보솜의 A 자리에 머물러 있게 될 것이므로 푸로마이신이 그 들을 방출시 킬 수 없을 것이다. 이러한 방식으로 작용하는 항생물질~ 에는 클로르데트라시클린, 팍타마이신, 보트로마이신, 티오스트랩튼 및 푸시 드산 등이 있다 . 이 방해뭉질들은 아미노아실-t RNA 가 리보솜의 A 자리 에 결 합하는 것 울 방해 한다 (Cundlif fe 와 McQ u il len , 1967 ; Cundliff e, 1971 ; Cundlif fe, 1972a) . 이 와는 대 조적 으로, 클로람페 니 콜, 스파르소 마이신 및 에리트로마이신은 생체 내에서 푸로마이신 반응을 방해한다. 그러므로, 이 방해물 질들은 펩티딜 기 전달효소에 작용하는 것으로 생 각되고 있다. 푸시드산은 EF-G 와 GDP 를 일시적으로 리보송 상에 붙잡아 둠으로 써 아미노아실-t RNA 가 A 자리에 결합하는 것을 막는다. 푸시드산 으 ­ 로 안정 화된 복합체 들은 무한정 하게 지 속하는 것 이 아니 다 . 푸시 드산으 ­ 로 처리한 원형질체에서는 결국에는 천천히 리보솜 회로가 다시 자리를 ­ 잡게 된다. 이 조건 하에서는 푸로마이신에 의한 갓 생긴 펩티드의 방 ­ 출이 스펙티노마이신, 린코마이신 및 셀레스티세틴 들에 의해서 방해된 다. 이러한 관찰은 이 방해물질들이 작용하는 단계는 펩티달 기 전달효­ 소이거나 자리옮김일 것임을 암시하는 것이다. 자리 옮김 반응에 관한 고전적 인 연구는 Haenni 와 Lucas-Lenard(1968) 에 의해서 처음으로 고안되었다. 그들은 A 자리에서 자리옮김 반응을 받을 수 있는 기질을 얻기 위해서 EF-G 가 없는 데서 N- 아세틸-dip h e­ tR NA 를 합성 한 다음에 EF-G 를 첨 가한 후에 N- 아세 틸 -d i p he- t RNA 가 푸로마이신과 반응할 수 있는 상태로 전환되는지를 추적하였다. 그` 이후로 비슷한 실험적 접근법이 설계되어 자리옮김에 관한 연구들이 이 루어졌다. 자리옮김을 방해하는 물질이라는 것이 처음으로 알려진 것은 에리트-

로마이 신 이 다. lga rashi 등 (1969) 은 이 항생 물질 이 EF-G 와 GTP 가 존 재해야만 일어나는 푸로마이신 반옹은 방해하지만 EF-G 와 GTP 에 의 존하지 않는 반응은 방해하지 않는다는 것을 알았다. 7. I. 3 리보솜의 GTPase 반응둘의 방해 EF-G 는 70S 리보솜 또는 50S 하위단위체와 함께 시험관 내에서 일어 나는 〈짝지워지지 않은〉 GTP 의 가수분해를 촉매한다. 이 반응은 티오스 트랩돈, 그리고 일정한 조건에서는 푸시드산에 의해서 방해 된 다 (Tanaka 등, 1968; Pestk a , 1970) . EF-G 는 자리 옮김 이 일 어 나는 도중에 작용하 프로, 이 두 항생물질들은 이 자리옮김 반응을 방해할 것이라고 널리 인 청하게 되었다. 실제로, 푸시드산에 저항성을 나타내는 E. coli 균주들 로부터 단리한 EF-G 는 이 항생물질들에 대해서 반응을 보이지 않는다 는 사실 이 그것 을 뒷 받침 하고 있 다 (Tocchin i - V alenti ni 와 Matt oc cia , 1968; Bernardi 와 Leder, 1970) . Bodley 동 (1970a) 은 푸시 드산이 리 보 송 •EF-G·GDP 복합체를 안정화시키기에 앞서서 한 차례의 GTP 의 가 수분해를 허용한다는 것을 증명하였다. 그러므로, 이 항생물질은 GTP 가 몰 당량 이상으로 과량으로 존재할 때만 짝지워지지 않은 GTPase 반옹을 방해 하게 된다• 그 다음에 Weis b lum 과 Demohn (1970) 그리 고 Bo dley 등 (1970b) 에 의해서 티오스트랩돈이 이러한 복합체들의 조립을 방해한다는 것이 밝혀졌다. 이 복합체는 시험관 내에서 GTP 나 GDP 로부터 형성될 수 있다. 거꾸로, 푸시드산이 존재하는 조건에서 EF-G 와 GDP 를 지니고 있는 리보솜은 티오스트랩돈에 의한 비가역적인 비 활성화로부터 보호된다는 것이 밝혀졌다(Hig hland 동, 1971). 이 관찰들은 생체 내에서 티오스트랩돈이 자리옮김에는 영향을 미침 이 없이 리보솜의 A 자리에로의 아미노아실-t RNA 의 결합을 방해한다 는 것이 알려침으로써 특별한 의미를 가지게 되었다. 이러한 관찰들과 일치 하는 결과둘이 Modolell 동 (1971) 과 Ki no shit a 등 (1971) 에 의 해 서 관찰되었다. 죽, 티오스트랩톤과 이와 관련된 화합물인 시오마이신과 터오펩티드는 시험관 내에서 EF-Tu 의존적으로 일어나는 아미노아실 -tRN A의 리보솜에의 결합과 리보솜과 EF-G 로 촉매되는 GTP 의 결 합 및 GTP 의 가수분해와 관련된 GTPase 의 작용을 동등한 세기로 방 해한다는 것이 밝혀졌다. 만일 리보솜이 그의 50S 하위단위체 상에 티

오스트렙톤에 대한 결합자리를 단 하나만 가진다고 한다면, 위에서 말 한 관찰들은 EF-Tu 와 EF-G 가 티오스트랩튼에 의해서 비활성화되는 50S 하위 단위 체 상의 단일

반하여 그밖의 아미노굴리코시드류는 〈무작위한 〉 오독을 일으킨다. 네 오마이신, 넓은 농도 범위에서 카나마이신 및 겐타마이신 동이 단백질 합성의 방해와 오독에 미치는 효과를 조사해 보면 그 효과가 다단계적 으로 나타난다. 예를 들면, 낮은 농도의 겐타마이신은 매우 근소한 오 독을 일으키면서 단백질 합성을 다소 방해하지만, 그 농도 를 중가시킴 으로써 오독이 더 중진되고 단백질 합성의 방해도 커지 기 시작한다. 겐 타마이신의 농도가 아주 높을 때는 단백질 합성의 방해가 매우 증가한 댜 이러한 효과로 보아서 이 항생물질들은 리보솜 상에 여러 결 합자리 들을 가지 는 것 으로 생 각된 다 (D av ie s 와 Davis , 1968) . 이 러 한 생 각은 실제로 이 항생제들에 대해서 저항성을 가진 여러 돌연변이체들이 발 견됨으로써 확인되었다. 이와는 대조적으로, 스트랩토마이신은 리보솜 의 단 한 자리에서만 결합하며, 단일 돌연변이체들을 쉽게 분리할 수 있다. 시험관 내에서 스트랩토마아신을 썼을 때 생기는 오독의 효과는 리보 송과의 비가 1 : 1 의 비일 때 최대의 수준으로 나타나며, 단백질 합성 의 방해의 수준과 비례한다 . 스트랩토마이신이 존재하는 조건에서 개시 반옹을 시작한 리보솜은 합성 속도가 낮고 오독 효과를 받는 상태이기 는 하지 만 mRNA 분자 를 따라서 계 속 이 동해 나아간다. 〈 스트랩 토마이 신-리 보솜〉 (비 가역 적 으로 영 향을 받은) 은 mRNA 로부터 이 탈된 다음에 도 무용한 존재로 있게 된다. 이 상태에서 〈스트랩토마이신-리보솜〉은 mRNA 및 f Me t-t RNNM• t와 불안정한 개시복합체를 반복해서 형성한 다. 이러한 복합체가 불안정하다는 것은 스트렌토마이신의 영향을 받은 리보솜이 한번 사용된 낡은 mRNA 에 억류되는 것이 아니라 계속해서 재이용된다는 것을 의미한다. 그러므로, 결합되지 않은 항생제를 제거 한 후에도, 〈스트랩토마이신-리보솜〉들은 재 mRNA 와 결합한 상태에 서도 새로 합성된 리보솜의 기능을 방해할 수 있다. 그렇기 때문에 스 트랩토마이신은 살균작용을 가지게 되는 것이다. 7.2 원핵세포의 리보솜에서의 항생물질의 결합자리 7.21 자연상태의 항생물질의 리보솜에의 결합 방사능으로 표지된 항생물질의 리보솜 또는 하위단위체들에의 결합은

여러 가지 방법으로 조사할 수 있다. 원심분리, 거르기, 침전 또는 추 출 등과 같은 방법들은 결합이 매우 단단해서 해리가 일어나지 않을 때 에만 응용할 수 있다. 활성탄소 또는 이온교환 수지 등으로, 결합하지 않은 항생제를 제거할 때도 유사한 고려를 해야 한다. 리보솜 또는 하 위단위체들에의 항생물질들의 결합에 대한 해리상수는 보통 5x10-1 M 내지 5x10-6 M 정도이다· 티오스트랩몬은 예의적이어서 매우 단단하게 50S 에 결합하기 때문에 해리상수를 측정할 수 없다• 대부분의 항생물 질들은 70S 리보솜과 1 : 1 의 비로 결합하며, 그 결합자리는 두 하위단 위체들 중 어느 하나에 있다. 그러나 농도가 클 때는 항생물질들은 〈이 차적인〉 결합을 할 수도 있다. 약간의 항생문질들은 2 : 1 의 1:l 1 로 각하 위단위체 상에서 강하게 결합하는데, 아마도 이러한 물질들은 리보솜에 이원적인 효과를 나타낼 것으로 생각된다 .• 리보송과의 결합자리에 대해서 경쟁적으로 작용하는 항생물질들도 많 이 있다. 이러한 항생물질들은 그들의 작용방식에 있어서 적어도 어떤 피상적인 상관관계가 있는 것으로 생각된다. 예컨대, 쿨로람페니콜, 린 코마이신 및 구게로틴 둘과 같이 펩티딜 기 전달효소의 작용을 방해하 는 물질들은 서로 경쟁적으로 작용하지만 티오스트랩튼이나 -자 리옮김 방 해물질인 네오마이신, 카나마이신, 겐타마이신, 비오마이신 및 두베르 악티노마이신 D 들과는 경쟁적으로 작용하지 않는다. 그러나 뒤에 말한 항생물질들끼리는 리보솜의 두 하위단위체 상에서의 결합에 대해서 서 로 경쟁한다. 7.2.2 항생물질의 친화표지 유사체의 리보솜에의 결합 항생물질들이 결합하는 리보솜의 특이한 자리들과 관련된 성분 단백 질들을 확인하기 위해서 친화표지 탐침이 많이 이용되고 있다. 이 문제 에 관해 서 는 Coop er man (1978) 의 평 론서 에 자세 히 기 술되 어 있다. 방사 능으로 표지된 탐침은 리보솜 상에서 항생물질이 결합하는 자리를 확인 하는 강력하고 직접적인 방법이 되고 있다. 일반적으로, 빛으로 활성화 될 수 있는 친화표지 탐침을 사용하는 것이 바람직하다. 왜냐하면 빛으 로 조사하기에 앞서서 탐침들이 리보솜과의 바공유결합성 상호작용의 득이성을 이물 수 있기 때문이다. 푸로마이신과 쿨로람페니콜의 몇 가 지 친화표지 유사체들을 그림 7-3 과 그림 7-4 에 나타내 었다.

제 7 장 단백질 합성의 방해뭉질들 427

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푸로마이신과 그의 유도체들을 사용하여 얻은 결과를 표 7-3 에 실 었다.

표 7-3 푸로마이신 및 그의 유사체들에 의해서 표지되는 리보솜 성분들 시약 표지된 리보솜 성분들 참고문헌 푸로마아신* L23 S14 RNA50 I Jay n e s 등 (1979) N- 에 틸 -2- 디 아조말로 S18 S14 Jay n es 동 (1978) 닐-푸로마이신* P- 아지 도 푸로마이 신* | L11 S18 (주성 분) 1 Ni ch ols 와 1S,32 S!,41 3 SL51 7 Ll8 L(27소 성 분) I Coop er man (1978> P- 아지도 푸로마이신* | L6 Ll3 L18 L22 L25 (주성분)| Krassnig g 등 (1978 〉 Lll L23 L27 L30 (소성 분) NB-At 요i오:신도n 아-P세he 틸 푸로 I L236S (R주N성A 분 ) , L2 (소성 분) || PGorenegn sw e등l1 ( 1동97 4(1) 974} * 빛으로 조사합 : RNA50 = 50S 하위단체로부터의 RNA. 그밖의 방해물질들의 친화표지 유사체들로 표지되는 예들을 들면 야 래와 같다. 스트랩토마이신의 아릴아지도 유도체 S7, S14 스트랩토마이신의 요오도아세틸 히드라촌 S4 클로람페니콜의 요오도아세틸 유도체 Ll6 클로람페니콜의 브로모아세틸 유도체 L2, L27 이러한 방법으로 앞으로 의미있는 결과들이 더 축적될 것으로 믿어자 지만 아직은 그 초기에 있는 실정이다. 7.2.3 리보솜의 부분적 재조립법에 의한 항생물질 결합자리의 조사 리보솜 내에서의 기능 자리들의 확인에 분할-재조립법이 사용되고 있 다는 것은 이미 제 2 장에서 기술하였다. 이 방법은 리보솜의 옹어리 입 자에다가 주어진 어떤 기능이 회복될 때까지 분할된 단백질들을 순차적 으로 첨가하여 성분 단백질의 기능을 추정하는 것이다• 비슷한 방법으­ 로, 항생물질의 결합자리를 생기게 하거나 완성시키는 데 필수적인 리 보솜 단백질들을 알아낼 수 있다. 이 방법은 항생물질이 실제로 결합하­ 는 리보솜 성분이 어느 것인지에 대해서 확실하게 알려 줄 수는 없지~ 친화표지 유사체들을 사용하여 얻는 정보를 보완할 수 있는 실험치들을-

계공해 준다. 재조립법은 N i erhaus 의 연구진에서 광범위하게 개발되었다. 그둘은 L16 이 클로람페니콜과 비르기니아마이신 S 가 E. col i의 50S 응어리 입 자에 결합하는 데 필수적 이 라는 것을 알았으며 (Ni er haus 와 Nie r haus, 1973 ; de Beth u ne 와 Nie r haus, 1978) , L15 와 함께 있 을 때 는 Ll6 이 예 리 트로마이 신과 결 합한다는 것 을 알았다 (Teraoka 와 Nie r haus, 1978) . 지금까지 알려져 있는 것으로서 리보솜에서 분리된 상태에서 항생물질 과 결합할 수 있는 단백질은 L15 인데 (Ll5 와의 결합에 있어서의 에리 트로마이신의 해리상수는 2X10-s M), L16 은 리보솜 내에서의 에리트로 마이신의 결합력을 증진시키는 것으로 생각된다 (70S 에 대한 에리트로마 이신의 해리상수 =10-8 M). 클로람페니콜이 펩티 딜 기 전달효소의 반옹 울 방해한다는 것은 앞에서 이미 말하였다. 그런데 이 항생물질이 Ll6 과 결합한다는 것은 Ll6 이 펩티딜 기 전달효소의 작용에 필수적이라는 것을 재확인해 주는것이다 (5.2.2 절을 보라). 항생물질과의 결합에 있 어서 이러한 방법으로 밝혀진 그밖의 단백질들은 티오스트랩톤에 대한 L11 과 디히드로스트랩토마이신에 대한 S3 또는 S5 이다. 23SrRNA 와 7 개의 단백질을 함유하고 있는 4M LiC l 응어리가 티오 스트랩튼을 게걸스럽게 결합한다는 것을 제일 먼저 안 사람은 Hig h land 등 (1975) 아었다. 최근에 티오스트랩톤과 결합하는 단백질아 L11 이며 이 단백질은 GTPase 의 작용과 · 관련된다는 것이 교차결합법으로 밝혀 겼 다 (Skold, 1983) . Str e p tom y ce s azures 에 서 는 L11 이 23S rRNA 의 A1067 과 결합하며, A1067 의 리보오스가 메틸화되면 티오스트랩돈에 대한 저항성을 가진다는 것은 이미 2.4.4 절에 언급하였다. 7.3 항생물질에 대한 원핵세포의 리보솜의 저항성 7. 3. I 리보솜 단백질들에 의해서 결정되는 저항성 항생물질에 대한 저항성을 가지고 있는 여러 가지 박테리아의 돌연변 이종들에 있어서 단 한 가지의 리보솜 단백질에 있어서의 돌연변이가 저 항의결정인자가 되는 경우가 많이 있다. 이것은 돌연변이체와 야생형 박테리아에서 유래되는 성분들을 함유하는 리보솜 하위단위체의 재구성

이 나 유 전학적 인 분석으 로 알 수 있 다 . 대표 칙 인 예 는 N omura 와 그의 공동연구자들의 스트랩 토마 이 신에 대 한 저항성에 관 한 것이다. E. coli 의 Str A 돌연변이체에서는 단백 질 S12 가 저항 성을 결정하는 인자가 되 고 있 다 (Ozaki 등, 1969) . 그밖에 도, S5 는 spc A 에 서 스펙 티 노마이 신 에 대한 저항성을 결정하 며, er y A에 서 의 L4 또는 ery B 에서의 L22 는 에리트로마이신에 대한 저항성을 결 정 한다 . 카수가마이신에 저항성인 ksgC 돌연변이체는 단백질 S2 가 변이되어 있다. 어떤 주어진 표현형은 리보 솜 성분들 중 어 떤 한 가지에 돌연변이가 일어남으로써만 얻을 수 있는 것 이 아니라 리보솜에 영향을 미치는 다 중성 돌연변이의 결과로서 얻을 수 있는 경우도 많 이 있다. 예컨대 eryA 균주 ( 단백질 L4 에 변 화 가 일어난 저항성 균주)는 s t rA( 단백질 S12) 또 는 s p cA( 단백질 S5) 돌연변이를 도입함으로써 에리트로마이신에 대해서 민감하게 된다 (Cundl iff e ( 1980) 에 인용됨)． 국단적인 예를 둘어 보면. 단백질 S8 에 변이가 일어난 스트랩토마이신-의존성 균주는 리보솜 단 백질의 어느 것에서든 돌연변이가 일어남으로써 스트랩토마이신에 관계 없는 균주로 복귀한다. 마지막으로 한 가지 더 예를 들면, 변이된 리보 솜 단백질들을 가 진 돌연변이체들과는 대조적으로, Bacil lus meg a te r iu m 과 B. subti lis ( Cundli ffe, 1980) 는 E. coli 의 단백 질 Lll 에 해 당하는 단 백질을 상실함으로써 티오스트랩몬에 저항성을 가지게 되는 돌연변이체 들도 있다. 7.3.2 리보솜 RNA에 의해서 결정되는 저항성 Helser 동 (1971, 1972) 이 처 음으로 밝힌 바와 같이 , E. coli 의 ksg A 돌연변이체들에 있어 서 의 카수가마이신에 대한 저항성은 16S rRNA 의 3' 말단 가까이에 있는 A1518 과 A1519 의 아데닌에 메틸화가 일어나지 않음으로써 생긴다 (2.4.4 절의 (나)항을 보라)． 야생형 균주에 존재하 는 메틸화효소는 ksg A 돌연변이체로부터의 30S 응어리에 작용할 수 있 다. 그래서 분리한 단백질들로써 재조립을 한 다음에는 리보솜(메틸화 된 30S 옹어리를 함유한 리보솜)은 카수가마이신에 대해서 민감하게 된 다. 메틸화효소는 16S rRNA 의 Al518 와 A1519 의 아데닌의 N6 위치 에서 디메틸화를 일으킨다는 것은 2.4.4 절에서 기술하였다 . 위의 경우와는 대조적으로, MLS 표현형 (마크롤리드류, 린코사미드

류 및 스트랩토그라민 B- 형 항생물질들에 대한 저항성)을 나타내는 ­ Sta p h yl o coccus 또는 Str ep t oc occus 의 균주들은 야생 형 에 비 하여 과도하 게 메 틸화된 23S rRNA 를 가지 고 있음이 밝혀 져 있다 (Lai 와 Weis b lum, 1971). 이러한 균주들에 있어서, 마크롤리드류의 하나인 에리트로마이 신을 방해효과를 일으킬 수 있는 농도보다 적은 양을 첨가하면 풀라스 미 드의 정 보를 받아서 생 기 는 효소가 유발되 는데 이 효소는 23S rRNA 내에서 약 두 개의 N6,N6- 디메틸아데닌 찬기를 생성시킨다. 이 렇 게 메 틸화된 23S rRNA 를 함유하는 리보솜은 시험관 내에서 마크 롤 리드 류 에 대해서 저항성을 가진다. 에리트로마이신을 생산하는 Str e p t om y c es eryt hr eus 로부터 의 23S rRNA 에 N6, N6- 디 메 틸 아데 닌 이 존재 한다는 것 은 이 생체에서의 리보솜의 저항성도 비슷한 메카니즘으로 획득되는 것 으로 생각된다. 7. 3. 3 티오스트렙튼에 대한 저항성 E. coli 세 포는 티 오스트랩 돈을 받아둘이 지 않으므로 티 오스트랩 튼­ 에 대 한 저 항성 은 자생 적 으로 생 기 는 Bacil lu s meg a te r izm z 과 Bacil lu s sub tili s 의 돌연변이체들을 가지고 연구되었다. 이러한 돌연변이체 몇 가 지물 면역학적으로 조사해 봄으로써 E. col i의 단백질 L11 과 면역학적 으로 관계가 있는 또는 〈 BS-L11 〉이 돌연변이체들의 리보솜 에서 없어진 것으로 나타났다. B. subti lis 돌연변이체가 터오스트랩몬­ 민감성인 것으로 복귀됨으로써 BS-L11 과 형식적으로 유사한 단백질을 다시 가지게 된다. B. meg a te r iu m 돌연변이체들은 복귀돌연변이룰 하 지 않지만 단백질 BM-L11 로써 그들의 리보솜울 재구성하면 야생형의 성질이 회복된다. 이렇게 재구성된 리보솜은 시험관 내에서의 단백질 합 성의 활동성을 두 배로 촉진시킨다. 따라서 이러한 계는 BM-Lll 의 생 리적인 역할을 연구할 수 있는 좋은 길을 열어놓았다. 위에서 말한 돌 연변이체의 리보솜에 단백질 BM-L11 을 첨가하면 폴리펩티드 사슬의 연장과 관련된 부분 반옹둘 중의 하나, 죽, EF-G 의존적으로 일어나는 GTP 의 가수분해 반옹만이 촉진된다 (Cundl iff e, 1980). E. col i의 단백 질 L11 을 단백질 BM-L11 대신에 넣어도 비슷한효과를 낸다. 따라서, Lll 과 BM-Lll 은 기 능적 으로뿐 아니 라 면역 학적 으로도 유사한 관계 가 있음을 알 수 있다. 이 연구결과들은 단백 질 L11 이 EF-G 의 존적 안

GTPase 의 반응에 관여 할 것 이 라는 암시 를 뒷 받침 하는 것 이 다 (Schie r 와 Moller, 1975) . 어떤 생체들은 그들 자신이 생산하는 항생물질들에 대해서 방어해야 하는 문제 를 안고 있 다. 티 오스트랩 돈을 생 산하는 St re p tom y c es azureus 에서 이것을 볼 수 있다. 이 생체로부터의 리보솜들은 티오스트랩톤과 결합하지 못하며, 티오스트랩톤의 포화용액이 존재하는 시험관내 조건 에서도 기능을 완전하게 나타낸다• 이와는 대조적으로 그밖의 Str e p to- my ce s 균주들로부터 의 리 보솜들은 티 오스트랩 돈에 매 우 민 감하다. 서 로 다른 출처로부터의 RNA 와 단백질을 함유하는혼성 리보솜의 재구성방 법 으로 시 험 해 봄으로써 S. azureus 의 23S rRNA 가 터 오스트랩 본에 대 한 저항성을 결정한다는 것이 밝혀졌다 (Cundl iff e, 1978). 이 생체로부 터의 리보솜 단백질들은 E. col i의 단백질 Lll 에 상응하는 면역학적 유 사체를 함유하며, 티오스트랩돈에 대해서 큰 친화력을 가진 결합자리를 다른 생체로부터의 rRNA 을 사용하여 재구성할 수 있다. S. azureus 의 추출액 은 23S rRNA 의 1067 번 위 치 의 아데 노신울 메 틸화하여 2'-0- 메틸아데노신을 만드는 메틸화효소가 있다 (Thom p son 동, 1982). 완전한 리보솜 또는 50S 하위단위체는 이 메틸화효소의 기 질 이 되 지 않는다. 23S rRNA 를 메 틸 화한 다음에 Bacil lus ste a roth e r-

표 7-4 S. azure11s 로부터의 티오스트랩론-저항 메틸화효소의 23S rRNA 에의 작용 235 rRNA 의 출처 (처 리) I(p8 5m 경 o추l/ p갭m겁 ol의 • 입결 자 합) 재 _?T현HpSm ~'Ip :+gT:H}S, S. coel. （메 틸 화되 지 않음) 0.98 o.78 0. 02 S. coel. （메 틸화 됨) 0.07 。 •89 o. 92 E. coli . （메 틸 화되 지 않음) 1. 04 0.82 0.06 E. coli . （메 틸화 됨) 0. 08 0.77 0.76 S. azureus. 0.06 0.75 0.76 * S- 아데노실메터오닌이 있는 데서 그리고 없는 데서 RNA 를 S. azureus 메틸화효소 로 항온처 리 한다. 그 다음에 B. ste a roth e rmop h il u s 단백 질 들을 가지 고 혼성 50S 입 자를 · 재조립한다. 기능 재구성의 분석 : 푸시드산이 있는 조건에서의 재구성된 입자, EF-G 및 [.H] - GTP 둘 사이의 복합체 형성. 티오스트랩몬 (THS) （복합체 형성의 방해물)을 입자들보다 3 배의 ; 과량으로 사용하였다.

mop lzi lu s 로부터 의 리 보솜 단백 질 을 사용하여 혼성 50S 하위 단위 체 를 재 조립할 수 있다. 이렇게 조립된 입자들은 티오스트랩돈에 대해서 저항 성을 가진다(표 7-4 를 보라). 7.4 진핵세포에서의 개시반응의 방해물질들 풀리 펩 티 드 사슬의 개 시 과정 은 개 시 tR NA (Met- tRN A,M ct) 를 80S 리 보솜의 정확한 위치에 부착시키는 데 필요한 4 단계의 순차적인 반응들 로 일어난다. 이 네 단계의 반응은 (a) 40S 하위단위체에 의한 eIF-3 의 인식과 eIF-2•Met- tRN A;Mc t• GTP 복합체의 결합, (b) eIF-1, eIF- 4A, eIF-4B, eIF-4C 및 mRNA 의 개 시 코돈 인식 , (c1) 단계 b 에 서 형 성 된 개 시 복합체 에 의 60S 하위 단위 체 의 부착, (c2) Met- tRN A1M•1 의 3' 끝과 펜티딜 기 전달효소 중심의 주개 자리와의 상호작용 등이다(그 림 7-5B). 7.4.1 개시 t RNA 의 인식을 방해하는 물질들 진핵세포에서의 단계 (a) 는 다음과 같은 반응들로 일어난다. 40S 하 위 단위 체 와 eIF-3 과의 상호작용, eIF-2• Met- tRN A1M•1 • GTP 복합체 의 형성, 그리고 이 복합체와 40S 하위단위체 (elF-3 을 함유하고 있는)와 의 상호작용. 카수가마이신이 박테리아의 30S 하위단위체와 개시 t RNA 의 상호작 용을 방해하는 것은 많은 실험적인 증거로 알려져 있지만, 진핵세포의 경우에는 아직 실험적인 증거가 얻어지지 않고 있다. 쇼도마이신 (N- 에틸말레이미드의 유사체), 아드레노크롬 및 트리페닐 메탄 염료(오린트리카르복시산, 피로카테콜 보라, 아주르 파랑 B, 산성 및 염기성 푹신 등)은 eIF-2•Met- tRN A1Me t• GTP 복합체의 형성을 방해 한다. 번역 방해물질(행에 의해서 조종되는 억제물질)이라는 단백질은 eIF-2 키나아제이며, 이 효소는 무세포 계에서 eIF-2 의 작은 하위단위체를 인산화합으로써 eIF-2·Met- tRN A1M•1•GTP 복합체의 형성을 방해한다는 것이 밝혀져 있다. 최근에 토끼의 망상적혈구의 추출물에 elF-2 를 촉

진하는 단백질 ( ESP) 이 있다는 것 이 발견되었 으 며 , 이것은 eIF-2-Met- tR NAt M et • GTP 복합체의 형성에 앞서서 일어나는 eIF -2·GTP 복합체의 초기 형성에 필요하다는 것 이 알려졌다 . 그 러므로, 번 역 방해물질에 의 해서 eIF-2 의 작은 하위 단 위체 가 인산화되면 eIF-2 와 ESP 와의 상호 작용에 의 한 복합체 형 성 이 방해 된다 (Haro 와 Ochoa, 1979) . 그러 나 eIF-2 의 인산화는 무세포 계에서는 관찰되었지만 진핵세포내에서 일어 난다는 것 이 보고된 적은 없다. 이 중가닥의 RN A 는 eIF-2 의 작용을 방해 하고 단계 (a) 를 막음으로 써 세포의 mR NA 와 비루스의 mRNA 의 번역을 방해한다(그림 7-5). 이 효과는 무세포 계에 다 과량의 eIF-2 를 첨가함 으로 써 극복할 수 있 다 . 단백질 합성을 방해하는 이중가닥의 RNA 의 역 할 에 관해서는 아직 확 실 한 것 이 밝혀져 있지 않지만, 인터페론으로 처리한 세포의 추출액 에 이중가닥의 RNA 를 첨가 하면 리보 솜에 결합되어 있던 핵산 내부가 수분 해효소를 활성화 시키며, 이 효소가 mRNA 들을분해한다고 보고 있 다 (Le w i s 등, 1978; Bag li on i 등, 1978). 인터페론으로 처리 한 세포의 추출액에는 번역을 방해하는 물질이 들어있다는 관찰도 보고되어 있다 (Zi lb erste i n 동, 1978) . 인 터 페 론으로 처 리 한 세 포의 추출액 에 서 는 pppA (2'p 5 ' A ) • 의 합성 이 활발하며 , 이 울리 고누클레 오티 드가 핵 산 내 부가수 분해효소몰 활성화시키 는 것으로 추측되고 있다 (Lew i s 등, 1978). 7. 4. 2 mRNA 인식 (단계 b) 의 방해물질들 이 무리의 방해물질로서는 트리페닐메탄 유도체들(제일 찰 알려진 것 은 오린트리카르복시산이다)， 몇 가지 아미노크롬류(제일 찰 알려진 것 은 아드레노크롬이다)， 황산 풀리덱스트란 및 황산 폴리비닐 등이 있다. 이들은 모두 복잡한 작용방식을 가지고 있어서 한 가지 이상의 상호작 용과 한 가지 이상의 방해작용을 한다. 이 방해물질들은 모두 40S 하위 단위체와 상호작용하기 때문에 무세포 계에 있어서의 mRNA 인식을 방 해한다. 그러나 이들은 세포 안으로 두과할 수 없으므로 완전한 세포에 는 사용되지 않는다. 앞에서 말한 바와 같이, 이 화합물들은 삼성분 복. 합체 eIF-2 •M et- tRN A1M•1 • GTP 의 형 성 을 막음으로써 개 시 tR NA 의 인 식을 방해한다. 이 삼성분 복합체의 형성에는 리보솜이 관여하지 않는 다는 것은 4.2.2 절에서 이미 기술하였다.

R中

<홀좋>0· u lrJ • •