틀co0H《 、 C三H,OH , 0 :틀 COOH \CH\,OH :-CH, OH H EH HH,

의 유도체와의 비교에서 그 구조 가 그 림 2.9 와 같음 이 확 립되었 다. 그림 2.9 에서 보여 준 CS 형 PG 의 연 결 부분의 구조는 척추 동 물 에 관 한 한 PG 의 원천 에 무 관 하게 동일하다. 그러나 무척추 동물 의 연 골 에서 얻어전 CS 형 PG 의 연결부분은 그림 2.9 의 구조와는 약간 차이가 있 을 것 으로 여겨진다. 예로, 오칭어 연골의 연 결 부분 은 Gal : Xy l : Ser 의 비 가 거 의 1 : 1 : 1 이 며 , 참게 (horseshoe crab: Li m ulus po lyp h ems) 에 서 는 Gal 나 Ser 에 비 해 월 등히 많은 xy lo se 폴 포함하고 있다. 이들의 CS 의 다당류 주사슬도 전형적인 CS 의 사슬과는 su lf a t e 함량에 약간의 차이가 있다. Dermata n sulf ate , hep a rin 및 hep a ran sulfa te 의 PG 는 CS 형 PG 와 동일한 연결 구조를 갖는다· 그러나 이미 언급한 바와 같이 KS 에서는 이들과 다른 연결 구조를 하고 있다. 각막 KS(KS -I )은 GlcNAc 와 Asn 의 NH 떠 사이 에 알칼리 에 서 안정 한 N-g ly c osid i c 연결 을 하는 반면 에 , 골격 KS(KS-Il )는 알칼 리 에 서 불안정 한 0-gl y c csi: lic 연 결 을 GalNAc 와 Ser 또는 Thr 의 OH 기 사이 에 하고 있 다. 이 들 KS 는 모두 sia l i c a c id, fu cose 및 mannose 등을 소량 포함하고 있다. KS-I 의 GlcNAc-Asn 연결은 mannose-GlcNAc 핵 을 갖는 gly c op ro te i n 의 전형 적 인 탄수화물― 단백질 연결의 유형이며, 따라서 이 PG이 mannose 를 함유하는 것은 충분히 예상할 수 있다. 골격 KS 의 구체적인 연결부분은 아주 복잡하며 아직도 명확하 지가 않다. 이 KS 는 단백질에 연결된 N-ace ty l g alac t osam i n y l 기 의 C-3 위 치 에 N-acety ln eurami ny l ga lacto se 가 연결되 어 있고, KS 의 주된 다당류 사슬은 C- 6 위치에 연결되어 있는것으로 여겨진다 (2.16). 그러 나 이 PG 에 서 흔히 발견되 는 mannose 및 fu cose, 그 리고 GlcNAc 에 비해 과량으로 존재하는 Gal 의 정 확 한 연결 위치 는 아직도 밝혀지지 않았다. 다만 mannose 는 연결부분 또는 이와 가까운 곳에 위치하고 있는 것으로 짐작되고 있다. KS 의 사슬이 반복되는 이당류 단위체로 구성되어 있으며, 에스 테르화된 황산기를 갖는다는 점에서는, KS 는 다른 PG( 또는 GAG) 와 유사하다· 그러 나 uronic ac id 를 포함하지 않으며 , 반복되 는 이

당류 단위체가 많은 g l y co p ro t e i n 에서 발견되는 것들과 아주 비슷 하다는 점에서는 PG 보다는 g l y co p ro t e i n(PG 와 구 별한 때)의 범주 해 포함시킬 수 있다· *추천문현 RI . H. Muir and T. E. Hardin g h am, Str u ctu r e of Prote o g ly c ans, in 1v.1' T P Inte r n. Rev. Sci. Bi oc hemi st r y Ser. One, Bi oc hemi st r y of carbohy d rate s , edit ed by W. J. Whelan. Balt imo re: Univ . Park Press, 1975, Vol. 5, p. 153-222. R2. U. Lin d ahl and L. Roden, Carbohy d rate - pe p tide link ag e s in pro te o - gly c a ns of anim al, pla nt and bacte r ia l orig in. In Glyc o p rot e i n s , edit ed by A Got tsc halk, 2nd Ed. , Elsevie r , Amste r dam, 1972, P. 491-517. *인용문헌 2. I. S. W. Sajd e ra and V. C. Hascall, Prote i n p ol ys a ccharid e comp le x from bovin e nasal carti lag e: A Comp a ris o n of low and high shear extr ac ti on pr ocedures, ]. Bi ol . Chem., 244, 77 (1969) . 2. 2. M. B. Math e ws and I. Lozait yte, Sodiu m chondroit inp r ote i n com- ple xes of cart i la g e . I. Molecular weig h t and shap e , Arch. Bi oc hem. Bi op lzy s. , 74, 158(1958) . 2. 3. V. C. Hascall and S. W. Sajd e ra, Prote i n p ol ys a ccharid e comp le x of bovin e nasal carti lag e: The fun cti on of gly c o p ro te i n in the for mati on of ag gr eg a te s , J. Bi ol . Chem. , 244, 2384 (1969) . 2. 4. T. E. Hardin g h am and H. Muir , The spe cif ic int e r acti on of hy al -uronic aci d wi th carti la g e pro te o g ly c a n, Bi oc him . Bio ph y s. Acta , 279, 401 (19 72). 2. 5. T. E. Hardin g h am and H. Muir , Hy al uron ic acid in carti lag e and pro te o g ly c a n ag gr eg a ti on , Bi oc hem. ]., 139, 365 (1974). 2. 6. T. E. Hardin g b am, The role of lin k -pr o te i n in the str uc tu re of carti lag e pro te o g ly c a n ag greg a te s , Bi oc hem. ]., 177, 237 (1979) . 2. 7. B. Cate r son and J. R. Baker, The lin k pro te i n s as spe cti c comp - onents of carti lag e pro te o g ly c a n ag gr eg a te in viv o , J. Bi ol . Chem. , 254, 2394 (1979) 밋 이 에 인용된 문헌 . 2. 8. B. Cate r son and J. R. Baker, The int e r acti on of lin k pr ote i n wi th

pr ote o g ly c an monomers in th e absence of hy a luronic ac id, Bi oc hem. Bi op hy s . Res. Commum, 80, 496 (1978) . 2. 9. L. Rosenberg, W. Hellmann and A. K. Klein s chmi dt , Electr o n mi cr oscop e stu d ie s of pr ote o g l yc an ag gr eg a te s from bovin e nasal carti lag e , ]. Bio l. C!z e m., 250, 1877 (1975) . 2. 10. J. K. Sheehan, I. A. Ni ed uszy n ski, C. F. Phelps , H. Muir and T. E. Hardin g b am, Self- a ssoc iat i on of pr ote o g ly c an subunit s from pig laryn g e al carti lag e , Bi oc henz. ]., 171, 109 (1978). 2.11 . M. B. Math e ws, Comp a rati ve bio c hemi st r y of chondroit in sulph -ate pr ote i n s of carti lag e and noto chord, Bi oc hem. ]. 125, 37 (19 71) . 2. 12. I. Scher and D. Hamerman, Isolati on of human sy no via l -flu i d hy al uronate by densit y-gra die n t ult ra centr i f uga ti on and evalu-ati on of its p r ot ei n conte n t, Bi oc hem. ]., 126, 1073 (1972) . 2. 13. A. A. Horner, Macromolecular hep a rin from rat skin : Isolati on characte riza ti on , and dep o lym e riz a ti on , J. Bi ol . Chem. , 246, 231 (1971). 2. 14. H. C. Robin s on, A. A. Horner, M. Hook, S. Og r en and U. Li n - dahl, A pr ote o g ly c an for m of hep a rin and its deg r adati on to · sin g le - ch ain molecules, J. Bi ol. Chem., 253, 6687 (1978) . 2. 51 . A. Oldberg, L. Kj el len and M. Hook, Cell-surfa c e hep a raa sulfa te: Isolati on , characte riz a ti on of a pr ote o g ly c an from rat live r membranes, J. Bi ol . Chem., 254, 8505 (1979) .

제 3 장 Glyc o sami no g ly c a n 의 일 차구조 Prote o g ly c an 의 탄수화물 부분인 gly c osami no g ly c an 은 대 체 로 반복되는 이당류 단위체로 구성되어 있으며, 이 단위체의 화학적 구 · 조에 따라 6 종으로 구분된다(표 1.3). Muco p ol y sacchar i des 의 생 물학 적인 기능은 이들의 물 리 화학적 특성에 기인되며, 이 특성은 ­ 일차 적 으로 GAG 의 화 학적 구조에 의해 결정된다. 이 장에서는 조 직에서 GAG 를 분리하여 화학적 구조를 결정하는 방법과 그 결과 · 롤 기술한다. 3. 1 Glyc osami no g ly c an 의 분 리 조직에서 GAG 를 분리시키는 것은 제 2 장에서 논한 자연상태의 PG 를 분리시키는 것보다는 훨 싼 간단하다. 이 경우에는 PG 의 중 심 단백질을 분해시키거나 탄수화물-단백질 연결을 파괴시키는 보 ­ 다 강력한 방법도 적용될 수 있다. HA 의 경우는 보통 단순한 물 또는 식염수 용액으로 이 다당류 몰 분리시키는 것이 가능하지만, 다른 GAG 에서는 알칼리나 단백 질 분해효소를 작용시켜 조직 (이에서 분리된 PG 포함)에서 탄수화물 ~ 을 방출시 킨다. CS 형 PG 등 대부분의 PG 는 xy lo se-seri ne 연결 울 하고 있으며, 이 연결은 알칼리 처리과정에서 쉽게 분해된다. 그러나 알칼리 처리에 의해 생성된 탄수화물 사술도 알칼리성 용액

에서 계속 분해되므로 , 특정한 연결 부분을 유지시키기 위해서는 알 칼 리 처리시 붕수소화물 (예로 NaBH 4 ) 을 첨가하여 x y lose 률 xy litol 로 환원시켜 더 이상의 탄수화물 분해를 피 할 필요성이 있다. 이와 같은 알칼리 처리 과정의 복잡성으로 인하여, 최근에는 알 칼 리 처 리는 xy lo se-serin e 연 결을 다몬 연결 (hy d roxy am i no 산에의 연결)과 구분하기 위해서만 사용되는 실정이다. 조직에서 GAG 를 방출시키기 위한 가장 보편적인 방법은 pa p a in 과 같은 단백질 분해 효소의 작용이다· 보통은 광범위한 목이성을 갖는 단백질 분해효소를 이용하여 격심하게 단백질을 분해시켜, 단 지 작은 찬여 펩티드만이 탄수화물 사슬에 남아 있게 하는 것이 바 람직하다· 그러나, 연결부분의 구조나 이 부근의 단백질의 구조를 연구하기 위해서는 보다 선택적인 효소를 사용하는 것이 요구된다. 단백질을 가수분해시칸 후, 탄수화물 성분을 분별하여 분리시키 기 위해서는, 분해 산물에 포함되어 있는 처분자량의 생성물과 소 량의 찬여 단백질을 제거하는 것이 요구된다. 이를 위해서는 tri - ·ch loroaceti c a ci d 로 단백질을 침전시켜 제거한 다음에, 여액을 두 석 (di al y s i s) 시 키 는 것 이 사용된 다. 그러 나 두석 과정 에 서 HP, HPS 나 KS 와 같은 처분자량의 다당류가 소실될 가능성이 있다(이는 두석 듀브를사용전에 약 85°C 에서 3 일 정도건조시킴으로써 막 을수 있다)． 두석에 대한 대응 방법으로에타놀이나 4 가 암모늄염 에 의한 침전을 이용한 GAG 의 정제가 대량의 다당류를 얻기 위하 여 사용되나, 이 방법에 의한 생성물은 약간의 불순물을 포함하고 있을 가능성이 크다. 눈의 유리체에서의 HA 또는 연골조직의 CS 와 같이 한 종류의 다당류가 주성분인 조직에서는 GAG 를 다시 분별할 필요성이 없 다· 그러나 대부분의 조직에서는 여러 종류의 다당류가 혼합되어 존재하고, 이들을 GAG 유형에 따라 분별하는 것이 필요하다. GAG 의 분별은 이돌간에 촌재하는 전하밀도의 차(예로 이당류 단위제당 HA 는 1, cs 는 2 그리고 HP 는 약 3.5) 와 에타늘에서의 용해도 차이를 이용하는 것이 보통이다. 에타놀에 의한 분별침전은 가장 간편한 반면에, l~2% 의 높은 다당류의 농도 및 충분한 염 (보동 식

초산염)의 존재룹 필요로 한다. 또한 KS 경우는 에타늘의 농도가 아주 높지 않으면 침전이 얻어 지 지 않는다. 이 방법 은 화학 구조가 극히 유사한 Cb4 -S, Cb6-S 및 DS 의 분별에도 적용된다. 예로 돼지 피부의 DS 와 CS 혼합문 은, 에타놀 농도가 30% 이하에서는 DS 가, 그리고 40% 이상에서 는 CS 가 침전된다. (D S 의 COOH 기는 CS 의 COOH 기에 비해 훨 싼 약산이다.) 다당류간의 전하밀도차를 이용한 또 다른 분별 방법으로는 전기 영 동법 , 이 온교환 chromato g rap h y , 4 가 암모늄염 에 의 한 침 전 등 여러가지문 들 수 있으며, 이들의 구제적인 내용은 참고문헌 Rl 에 잘 정 리 되 어 있 다. 다만 이 책 에 서 는 cety lp yridi n ium chlor ide (CPC)-cellulose 상에 서 여 러 다당류를 chromato g rap h y 에 의 해 분 별한 결고日卜 보임으로써 다당류간의 분별 서열의 일반적인 경향을 보이고자 한다.

표 3.1 CPC-cellulose column 에 서 의 GAG 의 분별 에 사용된 용리 액 (eluent) Eluent 용충된 다당류 1. 1% CPC Kerata n sulf at e 2. 0.3M NaCl Hy alu ronic aci d 3. 0. 3M Mg C 12 Hep a ran sulf ate 4. 40% pro p an ol-20% meth a nol Chondroit in 4-sulf at e -1. 5 % aceti c aci d 5. 0. 75M Mg C 12-0. lM aceti c acid Chondroit in 6-su lfat e 6. 0. 75M Mg C I2 Dermata n sulf ate 7. 1. 25M Mg C l2 Hepa rin

이 표에서 용리액의 이온 강도가 중대할 때 용리되어 나오는 다당 류의 순서 는 KS>HA>HPS>Ch4 -S >Ch6 -S >DS>HP 이 며 , 이 는 이들 다당류의 전하밀도의 서열과 거의 일치하고, 에타늘에서의 용 · 해도 서열과는 반대가 된다. 따라서 GAG 간의 에타늘에 대한 용해 도 차이도 전하밀도에 기인된다고 해석할 수 있다.

3. 2 Glyc osami no g ly c an 의 화학적 분석 조직에서 분리, 분별된 다당류의 목성은 분자량이나 거시적인 ~ 자형태로 규정될 수 있으나, 일차적인 특성은 이들의 화학적 성분 으로 결정되어진다. 표 3. 2 는 미 국의 국립 보건원 (Nati on al Insti tut e of Hea lt h) 의 지 원 으로 시 카고 대 학의 Math ews 와 Cif on ell i 교수가 세 계 의 여 러 학자 들에게 GAG의 표준시료로 제공하고 있는 GAG 의 분석결과를 요 약한 것이다. 여하한 GAG 에 대해서도 절대적인 표준시료는 존재 할 수 없으며, 따라서 이 표는 어떤 특정한 분리 조건에서 기대될 수 있는 결과의 전형적인 예로는 참조될 수 있다. 이 표에서 사용 된 화학적 분석방법은 다음과 같으며, 아돌은 GAG 분석에 많이 이 용된다. 1. 질소 : Kj el dahl 방법 을 이 용한다. 2. Uronic ac id : Di sc he(J . Bio l Chem. 147, 189(1947)) 의 carbazole 방법 에 의 한 홉광도의 측정 에 서 구한다. IdUA 와 GlcUA 는 서 로 발색 정도가 다르며, KS 는 uronic a ci d 의 특성이 아닌 황 색을 띤다. 3. Hexosami ne s : 개 량된 Elson-Morga n 법 (Bio c hem. ]. , 27, 1824 (1933) ）에 의한 발색법을 이용한다. N-sul fat e 된 hexosami ne 은 빨리 분해 하므로 N-acety la ti on 이 필요할 경 우가 있 다. 4, Sulf ate : 산성 에 서 가수분해 에 의 해 방출된 S04= 몰 BaCI2 로 침 전시 키 고 ge lati n 에 서 혼탁도를 분광학적 으로 측정 한다. N- sulf ate 기 는 약한 산성 가수분해 나 HN02 와의 반응을 이 용하 여 0-sulf ate 기 를 가수분해 시 키 지 않고도 측정 될 수 있 다. 5. 아미 노산 빚 기 타 당류 : 아미 노산 분석 기 나 chromato g r aph y 방법 (Carbohyd r. Res., 12, 39(1970)) 을 이 용한다. 7. Hexosam i ne 의 비 : 아미노산 분석기에서 측정된다. 8. Uronic acid 의 비 : NaBH4 로 환원시 킨 후 분해 시 켜 분석 한 다.

μ어μ여ω앙Z mgω검되|μ∞ .어it 。∞N. @.{N 。。. ∞。N. .。{{ [ ·〕(a。 i .。h i& 。.∞∞。 h.}。(。 .{。{ < N@---t- 잉$」i어ωm디강μ여gμ다N “lmSωm얻여i〕ω’Ri; … } ·h.여NN .N@ * N.∞.NN*∞ .‘”。.∞*a { .。.。N。 N.N。-φ- +.μi..‘. 〕{(.(。〕。(.a〕} @]-.i。v - am(a i.。。N。.va ma (.〕。。∞iv。。- - .。。a∞p.。(}。 .m。∞{。- - ia 。∞+。암+ (‘m〕(〕。 N iω다{써Qμi[ -.N 띠.。i .m%N h.Nh “μ .μ... ..μ.. .{。。。 。-iv。 - ]-N -[( ..μ.. •μi -.。{ a 강。+ 。(‘i〕(vi y 〕 i(γ쩌y ELQ섭i섭5 “-…iN닐ι-잉- .φN m.[m ω·{ m 어{.{ {。. m.a (。(〕〕· ][ 。.{.m。 ‘“」 .ι.. ‘. 4k‘ .i... .μ... l。g ‘。(띠(〕

5592 성인olasc t 각소막 공연 4 -1 -14 6~5155~1235 3,31

이들의 구체적인 방법은 참고문헌 R1 럿 이에서 인용된 참고문헌 의 참조플 추천한다. Uronic ac id 의 조성 은 오랫 동안 GAG 의 일 차구조에 있 어 서 콘 관심의 대상이 되었으며, 이의 결정은 앞서 언급된 많은 방법들% 복합적으로 이용하므로 다음에서 종더 구체적으로 취급하고자한다. Tay lo r 동 (3. 1) 은 HP 와 HPS 를 NaB3H4 로 환원 시 켜 얻 은 생 성 물 울 산 가수분해 시 켜 uronic acid 의 조성 을 방사능 chromato g r ap h y 로 측정하였으며, 이 반응의 과정은 그림 3.1 로 요약된다. 죽, 다 당류를 상온에 서 1-eth y l- 3-(dim eth y la mi no p ro p yl) -carbodii mi de (EDC) 로 pH 4. 75 에 서 반응시 킨 후, 삼중수소 (3H) 로표시 된 NaB3H4 와 50°C 에서 반응시켜 COOH 기를 환원시킨다· 두석으로정재한 시 료를 건조시키고 4N H2S04 로 100°c 에서 가수분해 (황산기 및 다당 류 사슬이 분해됨)후 HN02 로 아민기를 제거하고, 생성된 알데히 드기는 다시 방사능으로 표시되지 않은 NaBH4 로 환원시킨 후 방 사능 chromato g r aph y 에 서 분석 한다. 이 때 다당류의 L-idu ronic ac id 는 L-[3 H ]id o san ( II ) 과 L-[3 H )id i t o1 ( ill ) 로 얻 어 지 며 , D-gl u- curonic a ci d 는 D- 〔3 H)g lu cit ol(V) 이 된다· 또한 g lucosam in e 은 방사능으로 표시되지 않은 anh y dromann it ol(N) 로 전환된다.

巳 《：어 20H + 디CH2 어 C H,0H + :CH~C2 어H 2 어

당류 단위제와는 다른 탄수화물 구조를 갖고 있으며, 이에 의한 GAG 의 당류의 조성에 대한 영향은 분자량이 낮은 다당류에서는 무시 될 수 없 다. HP 및 HPS 는 D-gl u curonic ac id 와 L- id u ronic acid 를 uronic aci d 로 포함하고 있으며 , D-gl u curonic ac id 의 상 당량은 연결부분에 촌재한다.

3.3 반복되는 이당류 단위체의 구조 및 특성 GAG 는 일반적으로 특정한 조성의 반복되는 이당류 단위제로 구 성된 선형 고분자로 간주되고 있다. 그러나 이당류 단위제가 탄수 화물 사슬 전체를 통하여 동일하다거나, 같은 유형의 GAG 가 동일 한 이당류 단위체를 갖는다는 것은 이상적인 경우에 불과하며, 많 은 경우에는 상당한 구조상의 불균일성이 관찰된다. 3. 3. 1 Hy a luronic ac id Hy a luronic aci d 는 1934 년 에 Mey e r 에 의 해 소 눈의 유리 체 에 서 처음으로 분리되었다. 이 다당류는 관절활액, 피부 등 여러 결합 조직에서도 발견된다. 다른 GAG 가 모두 동물 조직에서만 확인된 것과는 대조적으로, 이 다당류는 A 군 포도상구균이나 많은 박테리 아에서도 촌재한다는 것이 확 인되었다. 이러한 점 외에도 HA 는 다 른 GAG 와 다른 몇 가지 특성을 갖고 있다. 이들은; 1. 분 자량이 아주 크다. 다른 GAG 의 분자량이 1Xl04~5Xl04 인 데 반하여 HA 는 1Xl06~5Xl06 의 분자량을 갖는다. 이는 이 분자의 유체역학적 부피와 관련하여 큰 의미를 갖는다. 2. 에스테로화된 황 산기를 포함하지 않는다. 3. HA 사슬과 단백 질 이 공유결 합을 한 pro te o g ly c an 으로서 의 존 재가 확 인되지 않았다. HA 의 산 가수분해 는 GlcNAc 와 GlcUA 간의 N-acety lg l u cosa-mi ni d i c 연결을 우선적으로 파괴시켜 GlcNAc 가 환원성 말단에 있 고 fil, 3 로 GlcUA 에 연결 된 이 당류 단위 체 인 hy a lobiu r onic ac id 가 생 성 된 다· 그러 나 고환 (tes ti cu lar) hy a luronid a se 를 작용시 킬 경 우 에 는 N-acety lh y a lobiu r onic ac id 두 단위 체 가 4-0-D- gl u cosami ny l 연결로 결합된 4 당류 단위체가 주생성물로 얻어진다. 이에 반하여 박테 리 아성 hy a luronid a se 에 의 한 분해 에 서 는 glu curonic acid 의 c-4 와 C-5 사이에 이중결합이 있는 hy a lobiu r onic ac i d 의 유도 체인 그림 3.2 의 화합물이 얻어진다.

o {COOHc ~。一Ac

위에서 언급된 바와 같은 부분적 산 가수분해, 효소에 의한 분해 등의 연구 결과로 HA 는 다음과 같은 반복되는 이 당류 단위체를 가 징이 밝혀졌다.

COOH CH20H

HA 는 용액에서 아주 거대한 음이온으로 존재한다. 용액 중의 HA 분자(실제는 염 또는 이온 상태이나 편의상 HA 로 지칭)는 야 주 큰 유체 역 학적 부피 (hy d rody n ami c volume) 물 차지 하며 (lg 의 HA 는 거의 1l 의 부피를 점유한다)， 이 부피 내에는 다른 거대 분자가 촌재할 수 없다. 따라서 이 분자는 조직 내에서 다른 거대분자의 확 산이나 접근을 방해하는 역할을 하리라 짐작되고 있다. HA 의 거 대한 유체역학적 부피로 인하여, HA 용액은 점성도와 탄성이 아주 크다. 이에서 HA 는 관절 표면의 기계적 s tr ess 를 흡수하는 완충

제 (shock absorber) 의 역할을 할 것이라는 것 을 짐작 할 수 있다· 또 한 이 다당류는 건(t endon) 의 표면이 나 활액 막과 같은 고제 -0각 제 계 면에서 윤활제의 역할을 하고 있다는 것이 제안되기도 했 다. 최근 에는 용액 중의 HA 분자는 기계적 에너지를 전기 적 인 것으로 전환 시키는 역할울 한다고 제시되기도 했다 (3·2). 이미 제 2 장에서 보 았듯이, HA 는 다몬 pro te o g ly c an 단위체가 집합체몰 형성할 때 중 심 연결자리를 제공한다. 이로부터 이 다당류는 chondroc yt e 에서 pr ote o g ly c an 을 합성 할 때 의 조절 작용을 하리 라 추측될 수 있으 나 (3.3), 이에 대한 실험적 결과는 아직도 완전히 긍정적인 것만은 · 아니다. 3. 3. 2 Chondroit in 및 Chondroit in s u lfat e Chondroit in 과 chondroit in sulf ate ( 4 및 6 sulfa te) 에 서 반복되 는 이 당류 단위체의 기본구조는 GlcUA 쁘 ~GalNAc 가 g1, 4 연젼로 결합된 것이다(그림 3,4). 죽 HA의 GlcNAc 대신에 GalNAc 가 포 함되어 있다. Chondroit in 은 많은 사람들에 의 해 서 는 보통 GAG 로 분류되 지 않으나, David s on 과 Mey e r (3, 4) 에 의 해 오칭 어 껍 질 과 소의 각 막 (cornea) 중에 촌재하는 다당류의 소량 성분으로 분리되었으며, chondroit in sulf ate ( CS) 생합성의 전도물질로 추정되고 있다. 이

,CO OH cC l/1'H60H \

다당류는 CS 를 HCl-me t . hanol 에서 처리한 후 알카리 가수분해시 킴으로써 쉽게 실험실적으로 얻음 수 있다 . 히믈 Ch6-S 에서 예를 들 어 보면,

Ocoo-O -• C QH,OSO; -: C H, 0COOCH°, 0CH,ONHH° COCH,

의 반응경로로 표시된다 (3.5). Chondroit in 4 및 6-sulfa te ( Ch 4-S 및 Ch 6-S) 는 정 확한 황산기 의 위 치 가 규명 되 기 전 에 는 각각 chondroit in sulf at e A 와 chondro- itin sulf at e C 로 불려졌 으며, 아직도 많은 문헌에는 이와 같은 명 명 이 이 용되 고 있 다· 초기 의 문헌에 서 는 chondroit in sulfa te B 라 는 다당류를 볼 수 있는데, 이는 다음 항에서 언급될 dermata n sulfa te 를 지 칭 한다. Chondroit in sulfa te 가 그립 3. 4 에 서 보여 준 반복되 는 이 당류 단위체로 구성되어 있다는 것은 단지 이상적인 것에 불과하며, 많 은 CS 형 다당류에서는 이 구조에 대한 상당한 변화가 su lf a t e 기의 위치 및 su lf a t e 화 된 정도에서 관찰된다· 소의 기관지 (t rachea) 에 서 분리된 CS 는 단지 GalNAc 의 일부분만이 sul fat e 화 되어 있으 며, 이는 매 3 번째 GalNAc 의 C- 4 에 황산기가 연결되어 있다고 제안되었다. 황산기의 함량이 낮은 CS 형 다당류는 사람의 혈장과 쥐의 갈비 (ri b) 에서도 분리되었다. 앞서 언급된 황산기의 함량이 낮은 CS 와는 반대로, sul fat e 화 된 정도가 큰 cs 도 여러 조직에서 분리되었다. 상어 연골의 CS 는 GalNAc 의 C- 6 에 황산기가 연결된 것 외에도, GlcUA 의 C-2 및

C-3 의 일부가 sulfa te 화 되 어 있 다. 이 과다하게 sulfa te 화 된 CS 롤 Suzuki( 3 . 6) 는 chondroit in sulfa te D 라 명 명 하였 다· 오칭 어 와 horseshoe crab 연 골에 서 분리 된 과다 sulfa te 화 된 CS 는 chon-droit in sulfa te D 와는 광회 전 성 (Op tica l Rot at i on ) 과 IR 스펙 트럼 이 다르다· 이 다당류는 GalNAc 의 4 빛 6 위 치 모두에 황산기 가 연 결 되 어 있 으며 이 를 chondroit in sulfa te E 라 부르기 도 한다• 이 당류 단위체당 2 개의 황산기를 갖는 또 다른 CS 형 다당류가 kin g crab 연골에 서 분리 되 었 다. chondroit in sulfa te K 라 부르는 이 당류는 GlcUA 의 C-2 또는 C-3 위 치 와 GalNAc 의 C-4 위 치 가 sulfa te 화 되 어 있 다. CS 의 GalNAc 의 C-4 또는 C-6 중 한 위치에만 황산기가 연결 된 이 상적인 Ch4-S 또는 Ch6-S 는 극히 희귀하며, 대부분은 혼합 형으로 촌재한다 (3.7). 혼합형 CS 는 보통 CS 형 다당류를 부분적 으로 효소분해시켜 생성된 4 당류 단위체의 구조에서 규명된다. CS 는 GAG 중 생체 내에서 가장 많은 양으로 존재하는 다당류이 다. 동일한 개체에서도 연골성 조직에 다라, 그리고 동일한 조직에 서는 성장상태에 따라 CS 의 양은 물론 CS 의 종류간의 비도 크게 차이가 난다. 일반적으로, 성장기에 있는 신생 또는 종양성 조직에 서는 많은 양의 CS 가 존재한다. 이에서 Diet r i c h 등 (3.8) 은 이 다 당류가 세포분화에 관여하며 세포의 인식이나 접착성과 같은 세포` 의 득정한 성질을 결정하는 인자일 것이라는 제안을 했다. CS 는 양이온, 득히 Ca+ ＋과의 결합력이 크다. 따라서 이 다당류가 결합 조직 의 광화 (mi ne rali za ti on ) 에 관여 하리 라 추정 된 다. 3. 3. 3 Dermata n sulf ate Dermata n sulfa te ( DS ) 는 1941 년 에 Mey e r 와 Chauff er 에 의 해 돼지 피부에서 처음으로 분리되었다. 이 다당류는 연골에서 분리된 CS 와 조성이 극히 유사하나 광회전성이 다르다. 아들은 CS 와 조 성 이 유사한 다당류라는 점 에 서 cbondroit in sulfa te B 라 명 명 하 였다. DS 는 또한 소의 허과 he p ar i n 의 부산물에서 분리되었으며, HP 와의 유사성에서 /3－ hep ar i n 이라고도 불렀다. DS 는 이외에도

돼 지 위 접 막(g as tri c mucosa), 건 (ten don), 심 장판막 (hear t value), 탯 줄 (umb ili cal cord) 빛 여러 섭유상 연골 등에서도 분리되었다. DS 의 반복되 는 아 당류 단위 체 의 hexosami ne 성 분이 GalNAc 라 는 것은 곧 확인되었으나, uronic ac i d 의 성분은 비교적 최근에야 밝혀 졌 다. Carbazole 발색 법 에 의 한 uronic acid 의 분석 은 단지 -G alNAc 의 50% 에 해당하는 GlcUA 의 색을 나타내며, 따라서 이 다당류의 uronic ac id 는 GlcUA 가 아닐 것 이 라고 짐 작되 었다. DS 의 uronic acid 의 주성 분이 L-id u ronic ac id 라는 것 은 1965 년 에 Hoff m an 에 의 해 규명 되 었으며 , gly c osid i c 연결은 Ch4-S 의 그것 과 동일하다는 것도 연이어 밝혀졌다.

CH20H

DS 사슬의 주축은 그림 3. 5 에 서 보듯이 IdUA-a (l, 3)-GalNAc 이당류 단위체가 /31 ,4 연결을 하고 있으며, GalNAc 의 C- 4 위치의 대 부분이 0-sulf ate 화 되 어 있 다. DS 와 Ch4 -S 의 차이 는 L-IdUA 와 D-GlcUA 의 차이이며, L-IdUA 의 a 연결은 D-GlcUA 의 /3연결 에 대응한다. HP 빛 HPS 도 L-IdUA 를 포함하고 있으며, 이들도 C 연결을 하고 있다. DS 도 CS 와 마찬가지로 그림 3.5 의 이상적인 구조에서의 상당한 변형을 보이고 있다. DS 사슬의 일부는 L-IdUA 가 아닌 D-GlcUA 로 구성 되 어 있음은 오래 전부터 지 적 되 어 왔으며 , Frasson 과 Roden (3.8) 이 고환 hy a luronid ase(/3 -glu curonid ic 연결을 분해)에 의해 부 분적으로 분해된 DS 의 분해산물에서 IdUA 와 GlcUA 를 모두 포 항하는 4 당류 단위체를 발견함으로써 확인되었다· 그러나 DS 의

GlcUA 의 함량은 전체 uronic ac id 의 20 % 룬 넘 지 않 는 것 이 보 통 이 다 . DS 의 0-sulfa te 화 는 GalNAc 의 C-4 위 치 뿐 만 아니 라, IdUA 의 일부에서도 관 찰 된다. 돼지 피부에서 얻어 진 DS 의 반 복 되는 이 당류 단위 체 는 C-2 또는 C-3 에 sulf at e 기 가 치 환된 IdUA 를 갖고 있으며 , 이 과다 sulfa te 화 된 DS 를 dermata n sulfa te D 라 부른 다 (3. 9) . 그리 고 hog fish 의 배 소 (noto c hord) 에 서 분리 된 DS 에 서 는 GalNAc 의 C-4 및 C-6 모두가 sulfa te 화 되 어 있는 이 당류 단위 체 가 발견 되 었 으며 , 이 를 chondroit in sulfa te H 라 부른다 (3. 10) • 3. 3. 4 Hep a rin 및 Hep a ran sulf ate HP 과 HPS 의 이 당류 단위 체 의 hexosami ne 은 glu cosami ne 이 며 , uronic ac id 는 IdUA 와 GlcUA 를 모두 포함하고 있 다· 초기 의 HP 빛 HPS 의 구조에 대 한 연구는, sulf at e 기 의 위 치 , N-acety l 기의 존재 유무, 당류간의 연결 등 다양한 구조적 측면에서 연구자 들간에 의견의 일치를 보지 못 했 다. 그러나 최근에는 비록 복잡하 고 시료의 원천에 따라 다르긴 하지만, 전체적인 구조의 모형이 정 립되었다. HP 의 uronic ac id 는 약 70~90% 가 IdUA 이 며 나머 지 는 GlcUA 이 다. 다른 GAG 들의 hexosami ne 이 거 의 완전히 N-acety l 화 된 것 과는 대 조적 으로, HP 의 glu cosami ne 의 대 부분은 N-sulfa te 화 되 어 있으며 , 단지 일부분만이 N-acety l 화 되 어 있 다· 또한 glu -cosami ne 의 대 부분은 C-6 에 , 그리 고 IdUA 의 대 부분은 C-2 에 ·0- sulfa te 화 되 어 있 다. 따라서 이 다당류는 이 당류 단위 제 당 2~3 개의 황산기를 갖고 있다. 단당류간의 결합은 모두 1-- ► 4 결합이며, id uronid i c 및 glu cosami n id i c 연결은 a 배향을, 그리고 glu curon- idi c 연결은 8 배향을 하고 있다. HP 의 구조적 특성을 대변하는 7 당류 단위제를 그림 3.6 에서 보이고 있다. HPS 와 HP 사이에는 명확한 구조적 차이는 없다. 단지 HPS 는 HP 에 비 해 N-acety l 정 도가 높고 (40~100%), IdUA 보다는 GlcUA 가 많이 포함되 어 있으며 , 0-su lfa te 화 된 정 도가 낮다. 따라서 .HP S 를 hep a rin monosulfa te 또는 bep a rit in sulf ate 라고 부르기

도 한다. 이 두 다당류의 구분은 구조적 차이보다는 항응고 작용의 유무로 행해지며, HPS 는 이 작용이 거의 없다. HPS 사슬에서는 N-acety l 또는 N-sulfa te 된 glu cosami ne 이 무작위 하게 배 열 되 어 있다기보다는, 이들이 부분적으로 모아져 있는 (blo ck> 공중합체로 여 겨 지 고 있 다. 그리 고 대 부분의 0-sulfa te 기 는 N-sulfa te 된 hexo- sami ne 보다는 IdUA 에 연결되어 있다.

의 항응고작용은 이 다당류의 sul fat e 의 함량보다는 분자량과 밀접 한 관계가 있다. 중합도가 8 인 처분자량의 HP 은 비록 이당류당 황산기가 2~2.8 개일지라도 거의 항응고작용을 보이지 않는다. 분 자량이 4,500~15,500 사이의 HP 에서는분자량과 항응고작용의 상 관관계는, 분자량이 10,000 까지는 분자량이 증가할 수록 항응고작 용도 중대되나, 이 이상의 분자량에서는 거의 일정한 값을 보인다 (3.12). 3. 3. 5 Kerata n sulf at e Kerato s ulfa te 라고도 불 려 지 는 kerata n sulfa te ( KS) 는 uronic ac id 대 신 에 D-ga lacto se 를 반복되 는 이 당류의 성 분으로 포함하고 있 다. KS 의 기 본적 이 당류 단위 제 는 D-ga lacto s e 과 GalNAc 가 서로 fil, 4 연결로 결합되어 있으며, 대부분의 GlcNAc 는 C-6 위치 가 0-sulfa te 화 되 어 있 다•

CH20H

KS 는 보통 탄수화물-단백질 연결 부분의 구조에 따라 구분된다 · (2.4 항 참조)． 각막 (cornea) 에 존재하는 KS(KS-I) 은 탄수화물 사슬 의 GlcNAc 가 중심단백질의 Asn 의 am i de 기에 알칼리에서 안정한 N-gl y c osid i c 연결로 결합되어 있으며, 연골조직에서 CS 와 공존하 는 골격 KS(KS-II )는 GalNAc 가 단백 질의 Thr 또는 Ser 에 0-gly - -co sid i c 연결을 하고 있어 알칼리에서 쉽게 분해된다. 그러나 이들 두 종류의 KS 에서 탄수화물의 구조에는 뚜렷한 차이가 없다. KS 의 sulfa te 함량은 KS 를 분리한 조칙에 따라 크게 변한다 (3.

13). 어 떤 KS 는 GlcNAc 의 C-6 위 치 도 sulfa te 화 되 어 있지 않은 반면에, 다른 KS 는 Gal 의 C-6 위치마처 sul fat e 화 되어 있다. 각 막 KS 는 sulfa te 기와 GlcNAc 의 비가 1 보다 적은 것이 보통인 반면에, 골격 KS 는 1.8 까지 되기도 한다. *추천문현 Rl . L. Roden, J. R. Baker, J. A. Cif on ell i and M. B. Math e ws, Isola- tion and characte r iz a ti on of connecti ve tiss ue po lys accharid e s, Meth o ds Enzy m ol. , 28, 73~141 (1972) (G!yc osami no g ly c an 의 분리 및 분석 방법 을 상세 히 기 술) R2. R. W. Jea nloz, Mucop o lys accharid e s of hig h er anim a ls, in the Carbohy d rate s , edit ed by W. Pig m an, D. Horto n and A. Herp, Vol Il B, Academi c Press, New York, 1970, p. 589~625. (Glyc osami no g ly c an 의 화학을 주로 취 급) R3. N. Sharon, Mucop o lys a ccharid e s I: Chem ica l Str uc tu r e, in Comp le x carbohyd rate s , Addis o n-Wesley, Read ing , 1975, p. 258~281 . (Mucop o lys accharid e 는 물론 대 부분의 복합다당류의 화학을 취 급한 강의 노트) *인용문현 3. 1. R. L. Tayl o r, J. E. Shiv e ly, H. E. Conrad and J. A. Cif on ell i, Uron ic aci d comp o sit ion of hep a rin and hep a ran sulfa tes , Bi oc hemi st r y , 12, 3633 (1973) . 3. 2. T. W. Barrett , Mechanoelectr ica l tra nsducti on in hy a luron ic ac id salt soluti on in an entr o p y-d riv e n pr ocess, Phys io l. Che111. Phys . , 8, 125(1976) and Hy a luronic acid salt- a mechanoelectr ica l tran s_ ducer, Bi oc him . Bi op h y s . Acta , 385, 157(1975) 3. 3. C. J. Handley and D. A. Lowt he r, Inh ibi t ion of pro te o g ly c an bio s yn th e sis by hy a luron ic aci d in chondrocy tes in cell cultu re, Bi oc him . Bi op h y s . Acta , 444, 69 (1976) . 3. 4. E. A. David s on and K. Mey e r, Chondroit in, a new mucop o lys ac- charid e , ]. Bi ol . Chem., 211, 605(1954). 3. 5. T. G. Kanto r and M. Schubert, A meth o d for the desulf at i on of

chondroit in sulfa te, J. Amer. Chem. Soc., 79, 152(1957). 3. 6. S. Suzuki, Isolati on of novel dis a ccharid e s from chondroit in sul- fates , J. Bi ol . Chem., 235, 3580(1960). 3. 7. C. R. Falty ne k and J. E. Sil be rt, Cop o lym ers of chondroit in 4- sulfa te and chondroit in 6-sulf at e in chic k embryo ep iph y s es and oth e r carti lag e , J. Bi ol . Chem., 253, 7646(1978). 3. 8. L. A. Fransson and L. Roden, St ru ctu re of dermata n sulfa te. I. Deg r adati on by tes ti cu lar hy a luronid a se, ]. Bi ol . Chem . , 242, 4161 (1967): _. Il Characte r iz a ti on of pr oducts obta i n e d by by a luronid a se dig e sti on of dermata n sulfa te, J. Bi ol . Chem. , 242, 4170(1967) . 3. 9. A. Malmstr o m and L. A. Fransson, St ru ctu re of pig skin derma- tan sulfa te. 2. Demonstr a ti on of salfa ted idu ronic ac id resid u es, Eur. ]. Bi oc hem., 18, 431(1971). 3. 10. K. Anno, N. Seno, M. B. Math e ws, T. Yamag a ta and S. Su- zuk i, A new dermata n po lys ulfa te chondroit in sulfa te H, from - Hog fish noto c bord, Bi oc him . Bi op lzy s . Acta , 237, 173 (1971) 3.11. J. Ehrlic h and S. S. Sti va la, Chemi st r y and ph armacolog y of hep a rin , J. Pharm. Sci. , 62, 517(1973). 3. 12. S. S. Sti va la and P. A. Lib e rti , Phy s ic o cbemi ca l stu d ie s of frac - tion ate d bovin e hep a rin . 1V. Cu( Il ) bin d ing in relati on to pH , molecular weig h t, and bio lo g ica l acti vit y, Arch. Bi oc hem. Bi op hy s. , 122, 40 (1967) . 3. 13. J. A. Cif on ell i, A. Saunders and J. Gross, Kerata n sulfa te frac - tion s from bovin e and human tiss ues, Carbo. Res., 3, 478(1967)~

제 4 장 Mucop ol ys a cchari de 의 생 합성 Mucop o lys accharid e 는 체 내 에 서 pr ote o g ly c an 으로 존재 한다. PG 의 생합성에 관한 연구는 초기에는 피부조직을 주로 사용하였 다. 최근에는 연골조직이나 mas t세포 종양을 생합성 연구의 조직 원으로 주로 이용하고 있으나, 생합성 과정은 피부에서와 큰 차이 가 없다. PG 의 생합성 과정은 CS 에 대해서는 바교적 상세하게 알 려져 있으며, 다몬 다당류의 생합성도 CS 와 유사한 경로로 진행되 는일 반것적으 로경 로믿폴어 지기술고하 있고다,. 다이음 에장 에개서개는의 먼다저당 P류G의 의 합생성합과정성을에, 관c한s 와 HP 을 중심으로 적는다. 4.1 일반적 생합성 경로 Glyc osami no g ly c an 이 라는 다당류와 중심 단백질이 공유결합을 하 여 존재하는 p ro t eo g l ycan( 다른 당단백질에서도 동일)의 생합성에 관한 일차적인 관심은 탄수화물 사술과 중심 단백질의 생합성 순서 이 다. Puromy cin 이 나 cy c lohexim i de 와 같은 단백 질의 생 합성 을 선택적으로 억제하는 물질이 PG 에 당과 황산기가 첨가되는 것도 억제하는 것으로 보아, 당단백질 (PG 포함)은 모두 중심단백질이 먼 처 합성되고, 탄수화물 사슬이 이 단백질에 첨가되는 것으로 믿어 졌다. 그러 나 최근에는 xy lo se 나 {3 -x y los i de( 예로 P-ni tro pb enyl - ~-D-

xy!o sid e ) 가 배 양된 chic k embryo chondrocy te 에 서 의 CS 생 합성 에 서 는 pu romy cin 의 억 제 작용을 극복하는 것 으로 보고되 었으며 (4.1), 이는 적당한 조건 하에서는 중심단백질이 촌재하지 않을 때에도 CS 사슬의 합성이 가능하다는 것을 의미한다· 또한 PG 의 존재가 확립 되지 않은 HA 에서는 HA 다당류 사슬이 중심단백질이 없이도 생 합성될 가능성이 크다· 그러나 HA 는 합성단계에서는 PG 으로 얻 어지나, 합성된 HA 가 주위 매체로 방출될 때 적당한 탄수화물 연 결이 분해되어 조직 내에서는 단백질에 결합되지 않은 순수한 탄수 화물로 존재할 수 있다. 이는 새로 합성된 HA 가 세포막표면에 연 결(탄수화물―단백질의 공유결합일 가능성이 큼) 되어 있는 것에서 짐작될 수 있다. 앞서의 몇 가지 불확실성에도 불구하고, 현재로는 PG 의 생합성은 합성된 중심단백질에 탄수화물의 사슬이 연결되는 것으로 여겨지 고 있다. 이때 탄수화물 사슬은 이를 구성하는 단당류에 해당하는 nucleo ti de- 당에 서 성 장중인 분자의 적 당한 위 치 에 당이 전 이 됨 으 로써 합성 이 진 행 된 다. 그러 나 L-id u ronic ac id 는 탄수화물 사슬 에 첨 가된 D-gl u curonic ac id 의 C-5 ep im eriz a ti on 에 의 해 형 성 된 다. 또한 0-sulfa tion 과 N-sulf ati on 도 고분자 상태 에 서 uronic ac id 와 N-acety lh exosami ne 의 변형 으로 일 어 난다. PG 의 생합성에 소요되는 당류는 g lucose 로 공급되며, 이는 ur idi n e dip h osp b ate ( UDP) 에 의 해 활성 화된 다· 그림 4. 1 은 PG 의 탄수화물 사슬의 생합성에 관련된 당류간의 상호전환을 보여 주 는 것이다. 비록 PG 의 생합성은 탄수화물 사슬이 중심단백질에 첨가됨으로 써 진행되는 것은 확실하나, 이 두 과정 (단백질 합성과 탄수화물의 첨가)간의 정확한 시간적 관계는 아직 명확하지가 않다. 탄수화물 사슬의 첨가가 r i bosome 에서 중심단백질의 합성이 완료되기 전에 도 시작될 가능성이 있다. (ovalb !l m i n 의 생합성은 이 경우에 속 한다.) PG 의 탄수화물 부분의 생합성의 시작은 중심 단백질과 다당류 사 술간의 연결 종류에 따라 각각 다른 과정으로 진행된다. CS 와 같이

GLUC!OASTEP

Xy l- Ser 연결 을 갖는 PG 에 서 는 Ser 기 에 UDP-xy lo se 에 서 xylo se· 를 직접 이동시킴으로써 생합성이 시작된다. 이와 유사하게, 골격 KS 에 서 는 Thr 이 나 Ser 의 OH 기 에 UDP-GalNAC 에 서 GalNAc 가 전이됨으로써 탄수화물 사술의 성장이 시작된다고 추정되나 아 직 확실 한 직 접 적 인 중거 는 없 다. 다만 상피 (ep ithe li al) muc in 이 냐 GalNAc-Thr 연결을 갖는 다른 g l y co p ro t e i n 들에서 관찰된 탄수화 물 사슬의 합성경로가 골격 KS 에서도 적용되리라 믿어질 뿐이다. 박테 리 아의 복합탄수화물 (com p lex carbohy d rate ) 의 생 합성 에 는 지 질 (lipi d) 에 결 합된 당 중간체 가 관여 하는데 , 포유동물의 조직 에 서 도 유사한 중간제가 당단백질의 생합성에 작용할 가능성이 있다· 포 . 유동물에 서 는 do li chol( 그립 4. 2) 이 미 생 물에 서 의 짧은 사슬의 iso p r - eno i d 에 대응하여 탄수화물의 생합성에 관여할 것으로생각되고 있

다. 각막 KS 의 GalNAc-A s n 연결 은 doli ch ol 경로 를 통해 합성된 다는 몇 가지 실험적 인 중거 가 보고되었다 (4.3),

-·o--ooPI -0— CH2 — CCHH3- C H2 -( CH2— C H=? CH— 3 CH2 )1 — 5~20C H2-•

탄수화물―단백질의 연결을 시작으로 하는 탄수화물 사슬의 성장 은, nucleo ti de- 당에 서 단당류를 성 장중인 PG 의 탄수화물의 끝부 분에 단계적으로 이동시킴으로써 계속된다. 이 과정은 당전이효소 (g l y cos ylt rans fe rase) 의 기 질 목이 성 에 의 해 조절 된 다 (R 2) . 즉 어 떤 특 정 한 gl yc osy lt r a nsfe r ase 는 첨 가되 는 단당류, 이 것 이 첨 가되 는 위 치, 형성되는 연결의 구조와 배향 (a 또는 /3）을 결정한다. PG 의 탄수화물 사슬의 성장이 종료되는 메카니즘은 아직도확실 하지 않다. 많은 gl yc op r ote i n 에 서 는 sia l yl t r a nsfe r ase 에 의 해 탄 수화물 사슬의 끝에 sia l yl 기 가 도입 되 어 다른 gl yc osy 1t r a nsfe r ase • 7} sia l yl 기 에 다른 당을 첨 가시 킬 수 없으므로 탄수화물의 성 장이 종 료된 다. (GM2 ga ng lisi d e 에 는 두번째 sia l yl 기 가 도입 될 수 있 다. ) 이와 유사한 GAG 생합성의 종료 메카니즘으로 CS 의 0-sulfa tion 을 둘 수 있다. CS 의 GalNAC 의 C-4 위치에 황산 기 를 도입하면 GlcUA 의 첨가가 방해된다· 그러나 C-6 위치에 황산기를 도입시킬 때는 GlcUA 의 첨가가 계속되는 것으로 보아 sulf ate 화된 다당류 사슬의 종료와 hexosami ne 의 sulfa te 화 의 관계 는 아직 도 명 확하 지는 않다. PG 에서 탄수화물의 성장의 종료는 어떤 특정한 종료 메카니즘에 의해서보다는, 세포의 배출기구에 의해 다당류 사슬이 세 포막에 결 합된 gly c osy ltra nsfe rase 와의 접 촉 범 위 밖으로 밀 려 나갈 때, 탄수화물의 성장이 종료될 가능성이 있다· PG 의 0-sulf ati on 은 이 미 탄수화물 사슬에 도입 된 uronic ac id

에 서 일 어 난다. 또한 GlcUA 의 ldUA 로의 ep im eri za ti on 도 고분 자 상태 에 서 진 행 된 다. HP 의 ep im eriz a ti on 은 N-desulf at i on 밋 N-ace ty la ti on 과 밀 접한 관계가 있으며, 이들 고분자의 변형은 다 음에서 취급되는 다당류의 개별적인 합성과정에서 상세하게 취급 된다. 4. 2 Chondroit in sulfa te 의 생 합성 Chondroit in sulfa te( CS) p ro t eo g l y can 은 중심 단백질에 탄수화 물이 Xy l- Ser 연결로 결합되어 있으며, 반복되는 이당류 단위제와 연결부분을 요약하면 다음과 같다. 巳 GlcUA~► 〔 G 『 INAc 무> GlcUAl 므 Gal 뜨 Gal 4 또는 6 sulf ate p一l, 4 x__ _y _ ,l 一~ Ser. 'CS 사슬의 합성 에 는 6 종류의 gly c osy lt r a nsfe r ase 가 관련되 어 있 으며, 이들의 존재 빛 기질의 선택성이 확인되었다(표 4.1), cs 의 생합성을 이의 진행순서에 따라 보기로 하자. Xy lo se-Serin e 연결 : CS 의 생 합성 은 PG 의 중심 단백 질 (합성 과정 에 있는 pe p tide 사술도 가능)에 있는 serin e 기의 OH 에 UDP-xy l ose 에서 X y l 을 이동시킵으로써 시작된다. 이 반응에 촉매 역할을 하 는 xy l osy ltra nsfe r ase 의 활성 은 1966 년에 암 탉의 난관 (o vi duc t) 에 서 처음으로 확인되었으며, 연이어 쥐의 지만세포종 (mas t ocyt oma), 수정 란 연골 (embr y on i c chic k carti la ge ), 뇌 (brain ) 등에서도 발견되 었다. 연골 PG 는 이의 중심단백질의 ser i ne 기의 약 50% 에는 당이 결 합되 어 있지 않음에 도 불구하고 xy lo se 의 수용체 (accept or) 로서 작 용하지 않는다. 또한 hy a luronid a se 를 써 서 CS 의 사슬을 짧은 oli go saccharid e 로 분해 시 켜 도 PG 의 찬여 serin e 기 는 xy lo se 의 수용체 로 작용하지 않는다. 이 같은 사실은 단백 질의 serin e 기 의 x y lose 의 수용체로의 역할은 거대한 CS 사슬의 공간적 방해에 의

표 4. 1 chondroit in sulfa t e 합성 에 관여 하는 당전 이 효소 빛 이 들 효소 의 외부기질 Enzym e Exog e nous accep tor s I. Xy lo syl tra nsfe r ase Smi th- deg r aded carti la g e pr ote o g ly c an L-Seryl g l y c y lg l y c ine 2. Galacto sy ltra nsfe r ase I D-Xy lo se 0-{3- D-Xy lo syl - L-serin e Meth y l, eth y l, b_u t y l, and octy l /3-D-x y lo p yran osid e Benzy l {3-D-xylo p yran osid e p-Ni tro p h eny l /3- D-xy lo p yi·an osid e 3. Galacto syl t r an sfe r ase II 4-0 -/3-D-G alacto s y l -D -xylo se 4-0-{3-D- Galac t os y l 一 0- /3-D-xy los y l- 도 ser i ne 4. Glucuronosyl t r an sfe r ase I 3-0-{3- D-G alacto sy l- D-ga lacto se 1,3 1,4 0 꿉-o- Galac t os y l- 。-/3-D-g alac t os y l- D-xy lo se 5. N-Acety lg a lacto sami nyl- GlcUA_ 玉 aINAc-GlcUA-GalNAc tran sfe r ase ― ► GlcUA 一 GalNAc (chondroit in hexasaccharid e ) GlcUA 一- ► (GalNAc-4S)-GlcUA 一 (GalNAc-4S) 一 GlcUA 一 (GalNAc-4S) (chondroit in 4-sulf at e hexasaccharid e ) 6. Glucuronosy lt r an s fer ase II GalNAc-GlcUA-GalNAc- ―- ► GlcUA 一 GalNAc (chondroit in p e nta s accharid e } (GalNAc-6S) ―- ► GlcUA ―- ► (GalNAc-6S) 一 GlcUA-(GalNAc-6S) (chondroit in 6-su lf at e pe nta s acchari de )

하여 결정되기 보다는, ser i ne 기 부근의 아미노산 조성, 죽 중심 단백질의 일차구조에 의해 결정된다고 해석될 수 있다. 연골 PG 의 중심단백질에는 CS 와 KS 가 모두 연결되어 있다. CS 는 모두가 Xy l- Ser 연결을 하는 반면에 , KS 의 일부는 GalNAc- Ser, 그리고 나머지는 GalNAc-Thr 연결을 하고 있다. 이 PG 에서

는 CS 사슬이 어떤 특정한 Ser 에, 그리고 KS 가 다 른 Ser 에 연결 되며 나머지 Ser 은 다당 류가 철합 되지 않은 상태로 존재할 가능성 이 크다. 죽 xy lo sy lt r a nsfe r ase 는 단백 질 의 어 떤 목정 한 조 건을 만족시키는 Ser 기를 찾아 X y l 를 전이시켜 CS 사 술의 생합성을, 그리 고 GalNAc-tr a nsfe r ase 는 다몬 특정 한 Thr 이 냐 Ser 기 에 GalNAc 를 전이시켜 KS 사슬의 생합성을 시작 한 다고 여겨진다. ::::J... 러나, PG 의 CS 와 KS 사슬의 생합성이 중심단백질의 한쪽 끝에서 시작되어 점차적으로 단백질 주축을 따라 나아가는지, 아니면 단백 질 주축에 서 무작위하게 진행되는지는 알려져 있지 않다. CS 형 PG이 생합성되는 조직에서는 다른 다당류의 PG 도 합성 된다. 따라서 어떤 주어진 세포가 특정한 다당류에만 선택적인 xy lo sy ltra nsfe rase 만을 포함한다고 단정 할 수 없 다. 예 로, 연골세 포 (chondroc yt e) 에서는 CS 를 우선적으로 생성하기는 하냐, CS 와 유사한 경로로 합성이 시작되는 HPS 도 생성한다. 이에서 동일한 xy lo sy lt r a nsfe r ase 가 Xy l 로 연 결 된 여 러 다당류의 형 성 에 관여 한 다고 볼 수 있다. Xy lo sy lt r a nsfe r ase 는 PG 의 중심 단백 질을 Smi th 분해 시 켜 얻 어 진 생 성 물을 매 체 로 하는 aff ini t y chromato g ra ph y 방법 에 의 해 여 러 조직에서 분리 빛 정제되었다 (4.4). 이 효소는 분자량이 95,000 ~100, 000 이 며 , 분자량이 23, 000 및 27, 000 인 각각 다른 subunit 두 쌍으로 구성되어 있다. X y l 의 전이는 PG 의 새로운 다당류 사슬의 합성의 시발점인 동 시에, PG 전체의 생합성의 조절작용을 할 것으로 생각된다. UDP- Xy l 은 UDP-gl u cose 를 산화시 켜 UDP-GlcUA 을 생 성 하는데 관여 하는 UDP-gl u cose dehy d rog e nase 활성 의 강력 한 억 제 물(i nh i b it or) 이 다 (4. 5). 만약에 중심 단백 질 과 nuclo ti de- 당의 불균형 이 일 어 나 면, 이는 PG 의 합성에 큰 영향을 미친다. 예로, 충분한 양의 중 심 단백질이 합성되지 않으면 UDP-X y l 의 농도가 중가되고, 이는 UDP-gl u cose dehy d rog e nase 에 영 향을 미 쳐 UDP-GlcUA 의 생 성 이 감소하게 된 다. 이 는 UDP-GlcUA 의 decarbox .yla ti on 에 서 생 성 되 는 UDP-Xy l 의 생 성 을 감소시 키 게 된다. 따라서 탄수화물-단

백질 연결의 중요 우1 치에 x y lose 가 존재하는 것은 단백질과 탄수 화물 사슬의 생합성의 불균형에 민감하게 반응하는 조절 메카니즘 을 제공하기 위한 것으로 간주된다. Galac t ose 의 전이 : 중심단백질에 X y l 가 연결됨으로써 시작된 PG 의 탄수화물 사슬의 생 합성 은, 두 개 의 ga lacto s y l 단위 의 연속적 인 첨가로 이어진다. Gal 의 전이는 다음의 두 과정으로 진행된다. UDP-Gal+Xy l -t Gra anlascfet or as yse l - I _► Gal- /3－ (l-+4)-X y l+UDP UDP-Gal+Gal-/3- (l-+4) Xy l tra n~sfe rase II 국 Gal- /3－ (1-+4) -Gal-/3 ( l-+4)-Xy l+ UDP. 첫 단계의 Gal 전이에는 X y l-Ser 이 보다 좋은 Gal 의 수용체 이긴 하나, 단당류인 Xy l 및 이의 유도제에도 Gal 가 전이된다. 또한 두번 째 Gal 전 이 반응에 서 는 Gal-/3 (l-+4)-Xy l 가 외 부기 질 (exog e nous subs t ra t e) 로 사용될 수 있 다. Gal 전이의 두 반응에서 Gal 의 수용체 간에는 어떤 경쟁적인 관계 가 존재 하지 않는다. 즉, 반응물에 D-xy lo se 를 첨 가해 도 이 것 이 Gal 가 Gal-X y l 에 첨가되는 것에는 영향을 미치지 않으며, Gal- X y l 의 존재도 Gal 가 X y l 에 첨가되는 것에 영향을 주지 않는다. 이 는 앞의 두 Gal 전 이 과정 에 는 각각 다른 ga lacto s y !tra nsfe r - .as e, I 및 JI 가 작용하고 있음을 의미한다• Galacto s y ltra nsfe r ase I 은 탄수화물 사슬의 합성 을 시 작하는 x y los y l t rans f erase 와 어느 정도의 독이한 상호작용을 보인다. •Ga lacto s y ltra nsfe r ase I 은 xy lo sy ltra nsfe r ase 가 존재 할 때 는 .xylo sy lt r a nsfe r ase 의 항제 (anti bo dy ) 에 의 해 침 전 이 형 성 되 나, 이 효소만 있을 때는 침전이 얻어지지 않는다· 또한 약간 정제된 효소 를 부동화된 xy lo sy ltra nsfe r ase (sep h arose 에 공유결 합 또는 sep - harose 에 연결된 중심 단백 질에 흡착된 상태) 가 포함된 column 에 통과시 키 면, 비 교적 순수한 ga lacto s y 1t r a nsfe rase 가 높은 이 온강 도의 세 제 용액 의 용출에 서 얻 어 진다. Galacto s y1 t r a nsfe rase 의 완 전한 활성에는 인지질(p hos p hol ipi ds) 을 필요로 하는 것으로 보인다.

이 는 수정 란의 연골에 서 얻 어 진 mi cr osomal pe llet 에 ph osph oli pa se· C 룰 작용시키면 효소의 활성이 약 25% 로 감소하나, 인지질등을 침 가하면 활성이 재생되는 것에서 알 수 있다 (4.6). Gal-Xy l 에 Gal 을 전 이 시 키 는 효소인 ga lacto s y tra nsfe r ase II 는 4-0- 로 치 환된 xy lo se 을 Gal 다음에 갖는, 보다 큰 Gal 의 수 용체를 필요로 한다. 이 효소는 단당류인 D-g a lacto s e 나 Gal-/3- (1 _► 3)-Gal 에 는 ga lacto s e 를 전 이 시 키 지 않는다. 따라서 이 효소는 _ 단지 말단 단당류 수용체 뿐만 아니라, 다음의 당 (x y lose) 까지도 인 식 한다고 볼 수 있 다. 이 와 같은 ga lacto s y lt r a nsfe r ase II 의 수용체 선 택 성 때 문에 Gal-Xy l 이 당류 단위 체 에 는 단지 한개 의 ga lacto s e· 만이 첨가된다고 볼 수 있다. Glucuronic aci d 의 Galacto s e 로의 전이 : CS 의 탄수화물-단백 질의 연 결 부분은 Gal-Gal-Xy l- Ser 에 GlcUA 가 UDP-GlcUA 에 서 전 이 됨 으로써 완료된 다. 이 반응에 관여 하는 glu curonosy1 t r a ns£erase 는 CS 의 반복되 는 이 당류의 합성 에 관여 하는 또 다론 glu curonosy L tra ns£erase 와는 다르다. 그러 나 이 효소의 선 택 성 은 앞서 언급된 ga lacto s y lt r a nsfe rase II 만큼 높지 는 않으며 , Gal-/3 -( 1-3)-Gal 나 다른 Gal 를 포함하는 화합물, 그리 고 약하기 는 하나 D-ga lacto s e· 도 UDP-GlcUA 에 서 GlcUA 가 전이 되 는 수용체 로 작용한다. UDP-GlcUA + Gal-{3 -( l-3) Gal 一 GlcUA- {3 -(1-3)-Gal- {3 (1-3)-Gal+UDP 반복되는 이당류 단위체의 합성 : CS 의 무제포 (cell free ) 생합성에 관 7 한 연구는 수정 란 연골 (embr y on i c chic k car til a g e) 에서 얻은 두세포 조제 를 UDP-GlcUA 와 UDP-GalNAc 와 함께 배 양시 키 면 sulf at e 화가 낮은 다당류를 형 성 한다는 것을 보였 다. 이 다당류는 N-acety l- ga lacto sami ny lt r a nsfe r ase 와 glu curonosy ltra nsfe r ase 의 두 효소 가 두 가지 단당류 성분을 성장하는 다당류 사슬의 비환원성 말단에 반복적으로 첨가함으로써 얻어진다. 비환원성 말단의 GlcUA 에 UDP-GalNAc 에 서 GalNAc 가 전이 되 는 것은 수용체 의 sulf ate 화 여 부에 무관하게 HA, Ch4-S 및 Ch6-S 에 서 얻 어 진 oli go saccharid e 에 서 모두 일 어 난다. HA 의 oli go saccharid e 가 CS 의 oli go sacchar-

i de 와 마찬가지로 GalNAc 의 수용체로 작용한다는 것은, GalNAc 의 전이는 수용체의 말 단 단당류에 의해서 결정되며 두번째 당류의 종류는 크게 중요하지 않음을 의 미 한다 (HA 와 CS 의 hexosami n e 은 각각 GlcNAc 와 GalNAc 로 서 로 다르다) . N-acety lg a lacto sami ny 1t r a nfe rase 가 기 질 에 대 한 선 택 이 없 음 에도 불구하고 생성되는 다당류는 아주 균일하게 얻어지는 것은 또 다몬 과정이 다당류의 생합성에 크게 관여하고 있음을 의미한다. 바 록. cs 와 HA 는 모두 chondrocy te 에 서 합성 되 나, 효소의 기 질 선택성의 결여에서 예상되는 HA-CS 의 혼성제 (동일 다당류 사슬에 GalNAc 와 GlcNAc 가 모두 포함)의 형 성 은 관찰되 지 않는다. 이 는 이들 다당류의 생합성이 세포 내에서 각각 다른 구획에서 진행되거 나, 아니면 다른 메카니즘에 의해 조절됨을 나타낸다. 이에 대한 한 가지 설 명 은, 내 질 망상체 (endop la smi c reti cu lum) 나 Golgi 체 의 막에 다가효소착물 (mul ti enz y me comp le x) 이 존재 하고, 이 효소착물이 주어 진 다당류를 다른 효소의 방해가 없이 잘 조절하며 합성한다는 것이 다. 이와 같은 다가효소 착물은 앞서 언급된 xylo sy lt r a nsfe r ase 와 ga lacto syl t r a nsfe rase 의 상호작용에 의 해 생 성 될 수 있 다. 그 러나, 아칙도 다가당전이 효소의 형성에 관여하는 효소들간의 상호 작용은 생체 내에서는 확립되지 않았다. UDP-GlcUA 에 서 GlcUA 를 GalNAc 에 전 이 시 키 는 데 촉매 작 용을 하는 효소인 glu curonosy l tr a nsfe r ase II (GlcUA-Gal 연결 에 관여하는 효소와 구별하기 위해 II 로 표시)는 비환원성 말단에 GalNAc 을 갖는 chondroit in 과 Ch6-S 의 oli go saccharid e 에 작용한 다. 그러 나 Ch4 -S 의 oli go saccharid e 에 는 이 효소에 의 해 GlcUA 가 첨 가되 지 않는다. 따라서 Ch4 -S 의 합성 에 서 는 GalNAc 기 의 C-4 위치의 su lf a ti on 은 GlcUA 의 첨가 이후에 일어난다고 볼 수 있 다. 이와 같은 GlcUA 전이효소의 기질 선택성에서 GalNAc 의 C- 4 -su lfa tion 이 CS 사슬의 종료 메 카니 즘으로 간주될 수 있으나, 이 에 대한 확실한 중거는 아직도 없다. Sulfa ti on : CS 의 생 합성 에 서 는 GalNAc 의 C-4 및 C-6 위 치 가 .s u lf a ti on 되는 것이 필요하다. 비록 sul fat e 화 된 nucleo ti d e-당

(UDP-GalNAc- i! S) 의 생합성이 관 찰 되기도 했으나, 이 nucleoti de -당 은 GAG 의 sulfa tion 의 중 간 체 는 아 니 다. GAG 의 sulf ati on 은 이 들 다당 류 의 중합 과 동시에, 또는 중 합 직후에 일어 난다 (4.7). GAG 나 다 몬 생 물 계 의 sulfa tion 반응에 서 sulfa te 기 의 donor 는 3'-ph osph oadenosy l- 5'-ph osph osulf ate ( PAPS) 이 며 , 이 는 APT 와 sul fat e 기 간의 두 단계 반응에 의해 생성된다. APT+su lf a t e:;;::= 푸 MP-sul fat e+ py ro p hos p ha t e (adeny ls ulfa te) AMP-sul fat e+ATP ― ➔ PAPS+ADP 이 반응에 의해 생성된 PAPS 의 구조는 다음과 같다.

H 。 -o-S 。II O- OI-IPI。 IO I C H PAPS

PAPS 의 합성 은 다른 nucleo ti de- 당의 합성 과 마찬가지 로 cy top la - sm 에 존재 하는 수용성 효소에 의 해 진행 된다. PAPS 에 서 sulf ate 기 몰 전이 시 키는데 촉매 역 할을 하는 sulfo tra nsfe r ase 가 존재 함이 확인되 었으며 , chondroit in 은 물론 비 환원성 말단에 GalNAc 를 갖 는 oli go saccbarid e (특히 홀수 개 의 단당류로 구성 된 것) 가 이 효소 의 기질로 작용한다. 지금까지 우리는 CS 의 생합성에는 6 종의 당전이효소가 관련되 어 있음을 보았다. 이 들 효소와 생 합성 과정 및 GalNAc 의 su lfat i on 을 요약하면 그림 4.3 와 같다.

iGG IflecPUU1AAcA:U--UAG: 二G- a®G:l :No 三\®AN :cAcSI-p•uc ® Os~o:I J / I- G 广 -lcG U lc: AUO-_G1} aG-l Xo二-l ,G-yG la- ol s-le-XXry y l\ - - SSeerr ~ INsAeG rc :<[\GXo :l-yX:DPu eyl 책\NiI l- p DSr eP r -DG pI.e GUupa A t f

GAG 의 생합성에는 2 개의 합성 조절메카니즘이 작용한다. 이 중 한 가지 는 이 미 언급된 UDP-GlcUA 생 성 에 대 한 UDP-Xy l 의 억 제 작용이 다. 또다른 조철은 hexosami ne 의 합성 과정 에 서 일 어 난다· UDP-GalNAc 는 UDP- Gl cNAc 와 평 형을 이 루고 있으며 , UDP 一 GlcNAc 는 fru.ct os e-6 -ph osp h ate 와 glu ta m ine tr a nsami da se 의 반응에 의 해 생 성 된 glu cosami ne -6-ph osp h ate 에 서 합성 된 다(그립 4.1 참조). UDP-GlcNAc 는 이 Fru .-6 -P 와 glu ta mine 반응의 억 제 물이 다. 따라서 다당류의 생 합성 이 느리 면 UDP-GlcNAc 의 농도가 중가되 고, 이 는 UDP-GlcNAc 생 합성 의 전도물질 인 GlcN-6-P 의 생성 속도를 감소시켜 전체 다당류의 합성이 조절된다. 이와 같은 -

UDP-GlcNAc 에 의한 다당류 합성 조절은 많은 g l y co p ro t e i n 의 생 합성에도 유사하게 적용된다. 4. 3 Hy a luronic ac id 의 생 합성 HA 의 반복되 는 이 당류 단위 체 는 GlcNAc-/3- (l-4 )GlcUA 이 며 , 이는 /3 1,3 연결로 결합되어 있다. 이 다당류는 1955 년에 Glaser 와 Brown(4. 8) 이 Rous Sarcoma 에 서 얻 은 무세 포 조제 중에 서 UDP-GlcUA 와 UDP-GlcNAc 에 서 oli go sacchari de 로 생 합성 되 었 다· 그 뒤 A 군 연쇄 상군(g rou p A s t rept ococ ci)에서 얻은 입 자상 효소 조제를 이용하여 거대분자의 HA 가 합성되었다. 많은 포유동물 조 ­ 직 조제 에 서 도 두 가지 nucleo ti de- 당에 서 고분자량의 HA 가 합성 되었으나, HA 사술의 생합성에 관한 구체적인 메카니즘은 아직 잘 알려져 있지 않다. CS 사슬은 중심 단백 질 에 UDP-Xy l 에 서 X y l 가 전이 됨 으로써 이 다당류 사슬의 생합성이 시작된다는 것이 확립된 반면에, HA 에서 는 CS 형 PG 와 유사한 PG 의 존재마처 확실하지가 않다. 그러나 · 단백 질 의 합성 을 완전히 억 제 시 키 는 pu romy c in 과 chloramp h enic o l 이 HA 의 생합성에는 거의 영향을 마치지 않는 것으로 보아 HA 는 ­ 순수한 다당류로 합성될 가능성이 크다고 볼 수 있다· HA 의 반복되는 이당류 사슬의 합성에 관한 연구도 극히 미마하­ 다· 그러나 이와 관련된 몇 가지 연구가 보고되었다. Str o olmi ller- 와 Dorf ma n(4. 9) 은 UDP-GlcUA 와 UDP-GlcNAc 가 모두 존재 할 때 고분자의 HA( 분자량 24,600) 를 합성하는 연쇄상구균계가 입자상 효소 조제를 UDP-GlcUA 와 배양시킬 때 GlcUA 한 단위를 전이시 킬 수 있음을 발견했다· 그러나 유사한 실험에서 GlcNAc 의 전이 는 확인되지 않았다. 또한 HA 에서 얻어진 6 및 5 당류 단위체를 연쇄상구군 효소와 필요한 nucleo ti de- 당의 혼합물에 첨가했을 때 에 도 이 들 oli go saccharid e 에 의 GlcUA 나 GlcNAc 의 첨 가가 관찰 되지 않았다. 이는 유사한 조건하에서 CS 의 o lig osacchar i de 에는· 당이 쉽게 전이된다는 것과는 아주 대조적이다. 따라서, HA 의 생

합성은 CS 의 생합성과 다른 경로로 진행될 가능성이 있다. HA 의 생합성의 가능한 하나의 경로로 지질 중간체가 제안되었 다. 이 의 한 가지 는 박테 리 아성 pe p tido g l yc an 이 나 다른 박테 리 아 성 다당류의 경우와 유사한 지질 중간체이며, 다론 한 가지는 포유 동물의 gl yc op r ote i n 중 GlcNAc-Asn 연결을 갖는 oli go sacchari de 의 형 성 에 관여 한다고 알려 진 doli ch ol pyro p h osp h ate 중간체 이 다 (그림 4.2 참조)． 그러나 아직도 HA 가 지질 중간체 경로로 합성된 다는 중거 는 없 다. 지 질 중간체 경 로의 특성 은 urid in e monop h os- p ha t e(UMP) 의 생성이다. UDP-GlcNAc+Dol-P-GlcNAc-P-P-Dol. +UMP 그러나 UMP 의 생성은 거의 관찰되지 않았으며, 오히려 UDP 의 생성이 쉽게 측정되었다 (4.9). 이는 GlcNAc 가 앞의 반응식에서 보 여 준 바와 같은 GlcNAc-1-ph osph ate 상태 가 아닌 GlcNAc 자제 로 전이됨을 나타낸다· 또한 지질-py ro p hos p ha t e 의 dep h osp h oryl at- ion 을 억 제 하여 pe p tido g ly c an 의 합성 을 막는 bac itra ci n 도 HA 의 생성에는 큰 영향을 주지 않음이 관찰되었다. 앞서의 지질 중간체 경로에 대한 부정적 실험 결과와는 달리, 지 질 중간체를 지지하는 실험 결과도 보고되었다. GlcUA-GlcNAc- P-P-Dol 인 이 당류一지질이 sim i a n-vir u s-40(SV 40) 으로 변태된 사람 의 허파 fi broblas t에서 분리되었으며, 이것이 GAG 의 형성에 관여 히는 지질 중간체일 것으로 생각되었다 (4.10). 그러나 이 이당류-지 질의 GlcUA-+GlcNAc 의 연결은 HA 의 1->3 와는 다른 1-+4 로 밝 혀졌고, 따라서 이 중간체는 HA 보다는 HP 생합성의 중간물질일 가능성이 크다. 4. 4 Dermata n sulfa te 의 생 합성 DS 의 구조를 Ch4-S 와 비 교하면, Ch4-S 의 반복되 는 이 당류 단 위 제 의 GlcUA 가 DS 에 서 는 L-id uronic a ci d(IdUA) 로 치 환된 것 과 IdUA 의 일부가 sul fat e 화 된 것 외 에 는 모두 동일 하다. (DS 의 ldUA-GalNAc 의 al, 3 연결 은 CS 의 GlcUA-GalNAc 의 {,1, 3

연전에 상응한다.) 지금까지 알려진 DS 의 생합성 과정은 CS 에서 확립된 과정과 갇 은 양상으로 진행된다는 것이 다. 다만 IdUA 는 성장하는 탄수화물 에 UDP-IdUA 에서 IdUA 가 전이되는 것은 아니며, 이미 다당류 에 결 합된 GlcUA 의 C-5 ep im eriz a ti on 에 의 해 생 성 되 는 것 으로 알려지고 있다. 이에 대한 구제적인 내용은 다음 항의 hep ar i n 의 생합성을 참조하기 바란다. DS 의 반복되는 이당류 단위체를 형성하는데 촉매작용을 하는 효 소들에 대해서는아직도구체적으로연구되지 않았다. 그러나 2 종의 당전 이 효소, glu curonosyl t r a nsfe r ase 와 N-acety lg a lacto s ami ny l- t rans f erase 가 존재할 것이라는 것은 쉽게 짐작된다. 후자의 효소 로 비 환원 성 말단에 IdUA 를 갖는 DS 의 oli go saccharid e 에 UDP- ' GalNAc 에서 GalNc 를 전이시킴이 관찰되었다 (4.11). 이 효소의 작 용은, HP 의 생 합성 에 관여 하는 N-acety lg l u cosami ny I tr a nsfe r ase 가 GlcUA (I dUA 는 아님)에만 GlcNAc 를 전이시키는 것과는 대조 적이다. 4. 5 Hep a ri n 의 생 합성 HP 는 hexosami ne 으로 D-gl u cosami ne (N-acety l 또는 N-sulf- · a t e 화 됨)을, 그리고 uronic ac i d 로는 GlcUA( 소량)과 IdUA( 다량) 을 함유하고 있다. Glucosam i ne 의 아민기가 대부분 N-sul fat e 된 것 외 에 도, 이 다 당류는 glu cosami ne 의 C-6 밋 IdUA 의 C-2 위 치 의 상당량도. sulfa te 화 되어 있다. 다당류와 중십단백질의 연결은 ·CS 와 유사한 GlcUA-Gal-Gal-Xy l- Ser 으로 구성 되 어 있 다. HP 및 HPS 의 hexosami ne -uronic aci d 연결는 a(l-+4) 로, 다른 GAG 의 /3 (1-+4) 와 차이 가 있 다· HP 의 탄수화물 주축의 합성은 CS 의 합성 경로와 거의 같으며 이는 다음과 같이 요약된다. L 중심단백질의 합성. 2. xy lo sy lt r a nsfe r ase 에 의 한 탄수화물 사술의 합성 시 작.

3. 두 가지 ga lacto sy I tr a nsfe r ase 와 gI ucuronosy I tr a nsfe r ase 에 의한 연결 부분의 합성. 4- N-acety lg I ucosami n y ltra nsfe r ase 와 gl ucuronosy I tr a nsfe r - ase 의 반복되는 작용에 의해 반복되는 이당류 단위체로 구성 된 탄수화물 사슬의 합성 . HP 의 sulfa tion 및 GlcUA 의 IdUA 로의 ep im eri za ti on 은 탄수화 물사슬의 합성과 거의 병행하여 진행된다. 이 과정의 HP 사슬의 변형은; 1. GlcNAc 의 N-deacety la ti on 및 N-sulfa tion 2. GlcUA 의 ep im eri za ti on 에 의 한 IdUA 의 합성 3- Glucosami n e 의 C-6 및 IdUA 의 C-2 위 치 의 sulfa tion 동이 다. HP 의 중심단백질의 합성에 대해서는 다른 PG 의 경우와 마찬가 지로 아칙 잘 알려져 있지 않다· 그러나 탄수화물-단백질 연결부분 의 생합성에는 CS 의 생합성에 관여하는 효소들이 여기서도 관여한 다고 여겨진다. 따라서 이 부분에 대해서는 CS 의 생합성을 참조하 기를 바란다. GlcNAc 의 전 이 (GlcNAc-a-(1--+4)GlcUA 연결 의 형 성 ) :HP 의 반복되 는 이 당류 단위 체 의 hexosami ne 은 UDP-GlcNAc 에 서 GlcNAc 가 성 장중인 다당류 사술의 비환원성 말단에 있는 GlcUA (I dUA 가 아님) 에 전이됨으로써 형성된다. 이 반응에 촉매 역활을 하는 N-acety l- gl yc osami n y 1 tr a nsfe rase 의 존재 및 이 의 기 질 특이 성 은 Heit ing 과 L i ndahl 에 의해 밝혀졌다 (4.12). 이들은 HP 을 HN02 로 분해시 키고, Dowex 50 에서 여러 탄수화물-단백질 연결부분을 분리하여 각각에 대한 GlcNAc 의 전이를조사했다. 이들의 결과는표 4.2 에 요약하였다. HP 의 연결부분을 포함한 분해 생성둘 A2, B1 및 B2 중에서 단지 B1 만이 GlcNAc 의 수용제로서의 활성이 관찰된다. 이 부분은비환 윈 말단에 GlcUA 와 IdUA 를 약 반씩 갖고 있으며 , 탄수화물-단 백질 연결부분 외에 2 단위의 반복되는 이당류를포함하고 있다· 그 러 나, B1 을 /3-glu curonid a se 로 처 리 한 B1_f3 에 서 는 GlcNAc 의

표 4. 2 Hep a rin 의 생 합성 에 서 의 가능한 GlcNAc 의 수용제 럿 GlcNAc 의 전이 HP 분해 부분 구 조 G전l cNAc 의이 Hy a luronic aci d GlcUA- ► GlcNAc- ► GlcUA-+GlcNAc + 6 당류체 -► GlcUA- ► GlcNAc •co mp o und A2 IdUA-+GlcNAc-+GlcUA-+Gal--.Gal -+X y l- ► Ser 값 om p ound Bz G !c UA- ► GlcNAc--.GlcUA-+Gal-+Gal -+Xy l- +Ser IIdUA 一 GlcNAc 코 UA 一 GIcNAc 一 GIcUA frac ti on B1 lGI-c►U GAa 一 巨 G Glac 巨NA cX- y► J U --A.S 一er G lcNAc 귁 GlcUA + -+Ga 巨 Gal-.X y !--.Ser IIdUA 一 GlcNAC 석 UA 一 GlcNAc 一 GIcUA frac ti on B1-~ lGl-c+NGAacl -一-. GUaAJ 귓- - . XGly cJ-N -A.Sce 귁r GlcUA 귁 Ga 巨 Gal 士 -+Xy l- +Ser

전이가 거의 관찰되지 않는다. 이는 GlcNAc 는 IdUA 를 말단에 갖 는 oli go saccharid e 에 는 전 이 가 일 어 나지 않음을 의 미 한다. 또한 B1 보다 이당류 단위체가 하나 적은 恥나 A2 에도 GlcNAc 는 전이 되지 않는다. 반면에, 반복되는 이당류 단위제가 3 인 HA 의 6 당 류체에는 비록 당류간 연결이 /3 (1 一 4) 가 아닌 /3(1 -3) 이지만 Glc- NAc 의 전이가 일어난다. 이와 같은 GlcNAc 수용체의 크기에 대 한 선 택 성 은 HPS 의 oli go sacchari de 에 서 도 관찰된다. 이 결 과는 HP 사슬의 생합성에 대한 에카니즘을제시하지 못한다. 따라서 HP 의 생합성에는 최소한 탄수화물-단백질 연결부분과 가까운 영역에 서는 지질 중간체가 관여하리라는 가능성을 배제시킬 수 없다. GlcUA-a(l->4)-GlcNAc 연결의 합성 : Helti ng 과 Lin d ahl 은 앞서 언급된 GlcNAc 의 전이와 유사한 실험을 GlcUA 의 전이에서도 수 행 하였 다. 쥐 의 masto cy tom a 에 서 수행 된 GlcUA 의 전이 실 험 은, 이 단당류는 이당류 단위체가 2 개는 몰몬, 1 개인 HP 연결부분 fr a g men t에도 전이됨을 보였다. 그러나, HA 에서 얻어진 비환원

성 말단에 GlcNAc 를 갖는 5 당류체에는 GlcUA 가 전이되지 않 았다. 따라서 HP 의 이 당류 단위 체의 생 합성 에 관 여 하는 gl ucur- osy I tr a nsfe rase 의 기 질은 마지 막 GlcNAc 가 f3 가 아니 고 a 배 향으 로 연결되어 있어야 한다고 여겨진다. HP 사슬의 변 형 : N-sulfa tion 은 이 미 다 당류 사슬에 도입 된 Glc-NAc 의 N-acety l 기 를 치 환시 켜 일 어 난다. HP 의 deacety la ti on 은 N-sulfa tion , C-5 ep im eriz a ti on 및 0-sulfa tion 등 일 련 의 HP 사 술의 변형에 대한 기폭제 역할을 한다. 이와 같은 다당류 변영은 ` 모두가 고분자 상태에서 일어나며, 고분자 사슬에서 명 확한 중간과 정을 거치면서 진행된다는 것이 밝혀졌다. 그러나 전반적인 변형은 아주 빨리 진행되며 완전히 sulfa te 화된 HP 사슬이 형성되는 데는 ` 30 여 초밖에 소요되 지 않는다. HP 사슬의 변 형 은 Sweden 의 Li n dahl gr oup 에 의 해 집 중적 으 . 로 연구되었으며, 이제는 전반적인 변형의 순서가 비교적 상세하게 알 려 졌 다. 이 들은 Furt h masto c y tom a 의 mi cr osomal frac ti on 을 UDP-GlcNAc 및 UDP 壬 13C]GlcUA 와 반응시키고, 일정 시간 후 PAPS 를 첨 가했 다· 또한 UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA 및 PAPS 을 반응 초기에 동시에 첨가하는 등 여러가지 비교실험을 수행하였다· 반응 혼합물을 pa p a in 으로 처 리 하고 DEAE-cellulose 상에 서 chr- omato g rap h y 로 반응 생 성 물을 분리 하였 다. Lin dahl g rou p에 의해 수행된 실험의 전형적인 생성물의 chro- ma t o g ram 을 그림 4. 4 에 서 보여 주고 있 다. PAPS 가 존재 하지 않을 때 의 UDP-GlcUA 와 UDP-GlcNAc 의 반응 혼합물에 서 는 두 가지 생성물이 확인되었다. 이 중 한가지는 HA 와 같은 위치 (困 ) I 에서 용출되며, 다른 것은 이보다 빨리 용출되었다. 빨리 용출되는­ 부분(田)은 HA 보다 낮은 전하밀도를 갖고 있는 것으로 해석되고, 따라서 N-acety l 기 가 deacety la ti on 되 어 생 성 된 것 으로 설 명 된 다. PAPS 가 존재할 때는 3 종류의 성분이 추가로 나타나며, 가장 늦게 용출되는 성분은 표준 HP 과 같은 위치에서 나타난다. 나 머지 두 성분은 그립 4.4 에서 보여 준 바와 같이 N-sul fati on 과 0-sul fati on(IdUA) 된 생성물로 밝혀졌다. 이 실험 결과에 따르는·

HP 의 생합성 과정은 대략 다음과 같이 요약될 수 있다. 1. HP 생합성의 일차적 생성물은 困번 위치의 GlcUA 와 GlcUAc 로 구성된 다당류이다. 2. 困 성분의 N-deace ty la ti on 은 자유 아민기를 갖는 띠번 성분 울 생성한다· 그러나 deace ty la ti on 은 단지 일부분(약 50%) 에 만 행해지며, IdUA 는 생성되지 않는다. 3. 자유 아민기 가 N-sulfa te 화 되 면 성 분 困을 생 성 하며 , N-ac- e ty l 정도는 약 25% 로 감소한다. 그러나 IdUA 는 거의 생성퇴 지 않는다. 4. GlcUA 의 ep im erase 는 N-sulfa te 화된 다당류에 작용하여 GlcUA 을 IdUA 로 전환시킨다. 이와 동시에 IdUA 의 C- 2 위 치가 O 一sul fati on 되며, 이는 囚위치에서 나타난다. 5. HP 분자는 glu cosami ne 의 C-6 위 치 에 0-su lfa tion 됨 으로써 생합성이 완료된다. 실험적으로는 HP 을 합성할 때 5 종의 성분이 완전히 구분되어 얻어진 것은, 실제 생제내에서의 HP 의 생합성은 몇 가지 과정을 통 ­ 하여 점차적으로 주어진 순서에 따라 진행된다는 것을 제시해 주고 ­ 있다. 그리고 HP 사슬의 여러가지 변형들은 이 과정에서 서로 연 관되어 진행됨을 의미한다. 만약 이들이 서로 임의로 일어난다면, 생 성 된 HP 고분자 사술은 N-sulf ati on , ep im eri za ti on , 0-su lf at i on 등에는 서로 상관관계가 없고, 따라서 생성물은 그림 4.4 와는 완. • 전히 다른 하나의 넓를 띠를 갖는 chroma t o g ram 을 보일 것이다. 그러나 이 결론은 어디까지나 실험실적 조건에서 얻은 결과에 의한 ­ 것이며, HP 의 생체 내에서의 생합성이 같은 형태로 진행된다는 것 은 아직 증명 되 지 는 않았다. 더 우기 대부분의 HP 은 약간의 N-ac-· ety l 기 를 포함하고 있 으며 , N-sulfa tion 정 도와 0-sulfa tion 정 도, 그리고 IdUA 의 함량 간에는 엄밀한 정량적인 관계가 성립되지 않 는 것으로 되어 있다· 앞서 언급된 HP 사술의 변형에 관한 몇 가지 추가적 정보를 다 ­ 읍에서 기술한다.

642

N-deacety la ti on 과 N-sulfa tion : HP 의 N-acety l 기 륭 제 거 시 키 는 deacety la se 가 Furth masto c y tom a 에 서 얻 은 homog e nate 의 100, 000g frac ti on p elle t에 존재한다는 것이 확인되었다. 이 효소는 [3H] 로 표시 된 N-acety l 기 에 서 〔떤〕 CH3COOH 를 방출시 키 며 , 효 소 활성의 최적 p H 는 6. 5 부근이고 완전한 활성을 위해서는 Mn. . + 이온이 필요하다. HP 의 N-deacety la ti on 은 이 다 당류의 변형 과정 을 전 반적 으로 조절 한다는 점 에 서 큰 홍미 가 있 다. N-deacety It i on 이 없 아 는 합 성 된 중간체 의 HP 이 N-sulfa tion , ep im eriz a ti on 및 0-sulfa tion 과정을 통해 완전한 HP이 되는 일련의 반응을 거칠 수가 없다. 따 라서 조직 내의 deace ty lase 의 활동도와 이의 조절이 HP 전도체 분 자가 HP 으로 전환될 것인지, 아니면 HPS(N-sulfa tion , 0-su lfa tion 밋 IdUA 화 정도가 HP 에 비해 낮다)로 될 것인가를 결정하는 중 요 인 자가 된 다. HPS 분자 내 에 서 발견된 HP 와 유사한 구조는 아마도 이 다당류의 합성 초기 단계에서 N-deacety la ti on 에 의해 형성된 것으로 간주된다. 이와 관련하여 mas t ocyt oma 의 0-sulfo tra nsfe rase 의 수용체 선 택 성 에 관한 연구는 0-sulfa tion 이 HPS 의 N-acety la ti on 된 부분에 서 보다는 N-sulfa te 화된 부 분에서 우선적으로 일어남이 관찰되었다. N-sulfo tra nsfe r ase 는 PAPS 의 sulfa te 기 를 자유아민 기 에 전 이 시키는 데에 촉매 역할을 하며, 이 효소의 활성은여러 조직에서 얻 어진 효소재계에서 확인되었다. N-sul fati on 은 자연 상태의 다당류 보다는 N-desul fat e 화 된, 죽 자유 아민기를 포함하는, 유도체에 서 더 용이하게 진행되며, 자유 아민기를 N-ace ty la ti on 시키면 sul fat e 기의 수용체로서의 활성이 85% 이상 감소한다. 이는 화학 적 또는 효소에 의해 deacety la ti on 된 자유 아민기에 s ulf a t e 기가 전이된다는 앞서의 결론과 일치한다. L-idu ronic acid 의 생 합성 : HP 이 나 HPS 의 uronic ac id 로 IdUA 가 존재한다는 것이 밝혀진 후, 이 uronic a ci d 의 생합성의 전도체 로서 UDP-IdUA 를 masto c y tom a 등의 조칙 에 서 확인 하려 는 많은 노 력이 행해졌으나 성공하지 못했다· 또한 HP 의 fr a g men t에 대한

GlcNAc 의 전이 실험에서 비 환원성 말단에 GlcUA 를 갖는 경우에 ’ 는 GlcNAc 가 전 이 되 나, IdUA 롤 갖는 frag m ent 에 는 GlcNAc 가 전이되지 않 음이 밝 혀졌 다. 이 제 는 HP 의 IdUA 는 합 성 단계에 서 UDP-IdUA 에서 전이되는 것이 아니 라 , 이 미 다당류에 도입된 . GlcUA 의 C-5 ep im eri za ti on 에 의 해 생 성 된 다는 것 이 확 립 되 었 다. Uronic ac id 의 고 분 자 상태 에 서 의 ep im eri za ti o n 은 algi ni c ac id 의 생합 성 에서 먼처 관찰되었다 (4.13). 해양 혹 조 (mar i ne brown alga e) 의 탄수화물의 주성 분은 D-mannuronic ac id 와 이 의 C-5 ep im er 인 L-gu luronic acid 로 구성 되 어 있 다. 이 두 uronic acic i 의 관계는 D-GlcUA 와 L-IdUA 의 관계와 동일하다.

H,OH 仁。 H,OH